Protelomerase

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Telomere spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der chromosomalen Stabilität und der Zelllebensfähigkeit in Zellen verschiedener Arten. Telomerase ist ein Enzym, das für die Verlängerung der Telomere in Zellen verantwortlich ist. Es handelt sich um eine Nukleoprotein-RNA-Polymerase, die DNA an die Enden der Chromosomen anfügt, um die durch die DNA-Replikation verlorenen Telomere zu verlängern und zu reparieren und die Anzahl der Zellteilungen zu erhöhen. Telomerase spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Integrität des Genoms, der langfristigen Aktivität der Zelle und der potenziellen Proliferation.

Bei normalen menschlichen Zellen ist die Aktivität der Telomerase jedoch streng reguliert. Nur wenige Zellen, wie Stammzellen und Keimzellen, können die Aktivität der Telomerase erkennen. Wenn die Zellen differenzieren und reifen, wird die Aktivität der Telomerase allmählich verschwinden. Darüber hinaus wird die Telomerase in Tumoren reaktiviert, was an der malignen Transformation beteiligt sein kann.

Unter Bakterien und Viren, einschließlich des Pflanzenpathogens Agrobacterium tumefaciens, linearer Plasmid-Prophagen, Escherichia coli, usw., gibt es eine einfache und gängige Lösung für das Problem der Chromosomenenden. Diese Organismen haben lineare Chromosomen oder Replikons mit kovalent geschlossenen Haarnadelenden. Die bidirektionale DNA-Replikation beginnt von einem internen Ursprung und produziert ein zirkuläres Dimer mit inversen Telomerwiederholungen an der Verbindung zwischen den beiden Kopien. Dann wird dieses zirkuläre Replikationsintermediat von einem spezialisierten Enzym namens Protelomerase in zwei lineare Chromosomen mit kovalent geschlossenen DNA-Haarnadeln zerlegt.

Abb. 1. Protelomerase löst replizierte Haarnadel-Telomere auf (Hideki, A.; et al. 2007)

Struktur der Protelomerase

Die Dimer-Kristallstruktur der Protelomerase TelK aus dem Klebsiella oxytoca Phagen fKO2 wurde berichtet. Jedes Monomer von TelK besteht aus einer N-terminalen Domäne und einer katalytischen Domäne, einem langen α-Helix (Helix K) als Verbindung, um diese beiden Teile zu verbinden, und bildet eine Struktur, die der Tyrosin-Rekombinase ähnelt. Jedes TelK-Monomer hat eine ovale Form (110A˚x 35A˚x 60A˚), die N-terminale Domäne hat eine Einfügung, die als Mündung bezeichnet wird, die die gegenüberliegende Untereinheit kontaktiert und eine Verschiebung im Pfad der DNA über die Dimeroberfläche erzwingt. Eine C-terminale DNA-Bindungsdomäne, die als Steigbügel bezeichnet wird, existiert nur in TelK und ist notwendig, um Haarnadel-Telomere aufzulösen. Die von TelK gebildeten Dimere bieten eine große Kontaktfläche für DNA, diese Oberfläche hält das 44 bp DNA-Substrat in einer gekrümmten Konfiguration mit einer zentralen Diskontinuität in der DNA-Helixachse. Der Kontaktbereich zwischen den beiden Untereinheiten ist groß, und die Wechselwirkung zwischen den Untereinheiten erfolgt hauptsächlich zwischen den N-terminalen Domänen und zwischen den katalytischen Domänen. Wenn es arbeitet, ist die DNA vollständig von dem Protein umschlossen, was eine relativ feste Umgebung während des Katalyseprozesses bietet, um die doppelsträngige DNA in der angespannten Konformation zu halten.

Abb. 2. A. Eine Ansicht senkrecht zur zweifachen nicht-kristallographischen Symmetrieachse, die zwei TelK-Untereinheiten in Orange und Cyan verbindet   B. Draufsicht entlang der zweifachen Achse (Hideki, A.; et al. 2007)

Anwendung

Einige Protelomerasen wurden identifiziert, die nicht die Wirkung haben, Telomerprobleme in vivo zu lösen, sondern beispielsweise Aktivitäten zur Einzelstrang-Annealing und ATP-abhängige Helikase-Aktivitäten aufweisen. Daher wird eine detaillierte Untersuchung dieser wichtigen Enzymklasse dazu beitragen, die Bedeutung der Einzelstrang-Annealing- und DNA-Entwindungsaktivitäten im Prozess der Replikation geschlossener linearer Chromosomen zu klären.

Protelomerase ist nicht nur unverzichtbar in Organismen, sondern hat auch eine einzigartige Bedeutung für die Biotechnologieindustrie. Es gibt bereits DNA-Konstrukte, die von Protelomerase auf dem Markt als verbesserter Klonierungsvektor mit hochrepetitiven Sequenzen produziert wurden, die eine stabilere lineare Struktur aufweisen und weniger anfällig für genetische Verluste während der Replikation sind. Protelomerase wurde auch für die Expression in gentechnisch veränderten E. coli-Zellen verwendet, um lineare eukaryotische Vektoren zu produzieren, die keine bakteriellen Sequenzen enthalten. Darüber hinaus ist Protelomerase ein wichtiger Bestandteil der Amplifikationsplattform, die von einem Unternehmen konstruiert wurde. Die Plattform verwendet einen zellfreien Prozess, um große Mengen DNA für therapeutische und industrielle Anwendungen zu produzieren. Da Antibiotikaresistenzgene eliminiert werden, wurde die Sicherheit verbessert. Lineare und minimale Vektoren können als DNA-Impfstoffe oder nicht-virale Gentherapie-Vektoren verwendet werden. Derzeit haben beide Methoden viel Aufmerksamkeit erhalten und auch viele Investitionen im Biotechnologiemarkt angezogen.