Protelomerase

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Telomere spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der chromosomalen Stabilität und der Zellviabilität in Zellen verschiedener Spezies. Die Telomerase ist ein Enzym, das für die Verlängerung der Telomere in Zellen verantwortlich ist. Es handelt sich um eine nukleoproteinische Reverse-Transkriptase, die DNA an die Enden der Chromosomen anfügt, um die infolge der DNA-Replikation verlorenen Telomerabschnitte zu verlängern und zu reparieren und die Anzahl der Zellteilungen zu erhöhen. Die Telomerase spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Genomintegrität, der langfristigen Zellaktivität und des Proliferationspotenzials.

In normalen humanen Zellen ist die Telomeraseaktivität jedoch streng reguliert. Nur wenige Zelltypen, wie Stammzellen und Keimzellen, weisen eine nachweisbare Telomeraseaktivität auf. Mit der Differenzierung und Reifung der Zellen nimmt die Telomeraseaktivität schrittweise ab und verschwindet schließlich. Darüber hinaus wird die Telomerase in Tumoren reaktiviert und kann an der malignen Transformation beteiligt sein.

Bei Bakterien und Viren, einschließlich des Pflanzenpathogens Agrobacterium tumefaciens, linearer Plasmid-Prophagen, Escherichia coli etc., existiert eine einfache und verbreitete Lösung für das Problem der Chromosomenenden. Diese Organismen besitzen lineare Chromosomen oder Replikons mit kovalent geschlossenen Hairpin-Termini. Die bidirektionale DNA-Replikation startet von einem internen Ursprung und erzeugt ein zirkuläres Dimer mit invertierten Telomerwiederholungen an der Verbindungsstelle zwischen den beiden Kopien. Anschließend wird dieses zirkuläre Replikationsintermediat durch ein spezialisiertes Enzym, die sogenannte Protelomerase, in zwei lineare Chromosomen mit kovalent geschlossenen DNA-Hairpins aufgespalten.

Abb. 1. Protelomerase löst replizierte Hairpin-Telomere auf (Hideki, A.; et al. 2007)

Struktur der Protelomerase

Die Dimer-Kristallstruktur der Protelomerase TelK aus dem Klebsiella oxytoca-Phagen fKO2 wurde beschrieben. Jedes TelK-Monomer besteht aus einer N-terminalen Domäne und einer katalytischen Domäne; eine lange α-Helix (Helix K) dient als Linker und verbindet diese beiden Teile, wodurch eine Struktur entsteht, die der von Tyrosin-Rekombinasen ähnelt. Jedes TelK-Monomer besitzt eine ovale Form (110 Å × 35 Å × 60 Å). Die N-terminale Domäne enthält eine Insertionsstruktur, die als „muzzle“ bezeichnet wird; sie kontaktiert die gegenüberliegende Untereinheit und erzwingt eine Versetzung im Verlauf der DNA über die Dimer-Grenzfläche. Eine C-terminale DNA-Bindedomäne, „stirrup“ genannt, kommt ausschließlich in TelK vor und ist für die Auflösung von Hairpin-Telomeren erforderlich. Die von TelK gebildeten Dimere stellen eine große Kontaktfläche für DNA bereit; diese Oberfläche hält das 44-bp-DNA-Substrat in einer gekrümmten Konformation mit einer zentralen Diskontinuität in der DNA-Helixachse. Die Kontaktfläche zwischen den beiden Untereinheiten ist groß; die Interaktionen zwischen den Untereinheiten erfolgen hauptsächlich zwischen den N-terminalen Domänen sowie zwischen den katalytischen Domänen. Während der Funktion wird die DNA vollständig vom Protein umschlossen, wodurch während der Katalyse ein relativ konstantes Milieu bereitgestellt wird, das die doppelsträngige DNA in einer gespannt gehaltenen Konformation stabilisiert.

Abb. 2. A. Ansicht senkrecht zur zweizähligen nichtkristallographischen Symmetrieachse, die zwei TelK-Untereinheiten (orange und cyan) zueinander in Beziehung setzt   B. Draufsicht entlang der zweizähligen Achse (Hideki, A.; et al. 2007)

Anwendung

Bei einigen Protelomerasen wurde festgestellt, dass sie in vivo nicht die Funktion der Lösung von Telomerproblemen erfüllen, jedoch beispielsweise Aktivitäten der Einzelstrang-Anlagerung (single-strand annealing) sowie ATP-abhängige Helikase-Aktivitäten aufweisen. Eine detaillierte Untersuchung dieser wichtigen Enzymklasse wird daher dazu beitragen, die Bedeutung von Einzelstrang-Anlagerung und DNA-Entwindungsaktivitäten im Prozess der Replikation kovalent geschlossener linearer Chromosomen zu klären.

Protelomerase ist nicht nur für Organismen unverzichtbar, sondern besitzt auch eine besondere Relevanz für die Biotechnologieindustrie. Bereits am Markt verfügbar sind durch Protelomerase erzeugte DNA-Konstrukte als verbesserte Klonierungsvektoren mit hochrepetitiven Sequenzen, die eine stabilere lineare Struktur aufweisen und während der Replikation weniger anfällig für genetische Verluste sind. Protelomerase wurde zudem zur Expression in gentechnisch modifizierten E.-coli-Zellen eingesetzt, um lineare eukaryotische Vektoren zu erzeugen, die keine bakteriellen Sequenzen enthalten. Darüber hinaus ist Protelomerase ein wesentlicher Bestandteil einer von einem Unternehmen entwickelten Amplifikationsplattform. Diese Plattform nutzt einen zellfreien Prozess zur Herstellung großer DNA-Mengen für therapeutische und industrielle Anwendungen. Durch den Verzicht auf Antibiotikaresistenzgene wurde das Sicherheitsprofil verbessert. Lineare und minimale Vektoren können als DNA-Impfstoffe oder als nichtvirale Vektoren für die Gentherapie eingesetzt werden. Derzeit finden beide Ansätze große Aufmerksamkeit und ziehen erhebliche Investitionen im Biotechnologiemarkt an.