TEV-Protease

Verwandte Lektüre

TEV-Protease ist eine hochspezifische Cystein-Protease, die die Aminosäuresequenz Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser) erkennt und zwischen den Gln- und Gly/Ser-Resten spaltet. TEV-Protease, auch bekannt als Tobacco Etch Virus (TEV) Protease, ist eine hochspezifische Cystein-Protease, die die Aminosäuresequenz Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser) erkennt und zwischen den Gln- und Gly/Ser-Resten spaltet. Sie wird häufig zur Entfernung von Affinitätsreinigungstags wie Maltose-bindendem Protein (MBP) oder Polyhistidin von Fusionsproteinen verwendet. TEV-Protease hat ein 7xHis-Tag für eine einfache Entfernung aus einer Reaktion unter Verwendung von Nickel-Affinitätsresinen und wurde so konstruiert, dass die thermische Stabilität verbessert und die Autolyse verringert wird.

Struktur

Derzeit hat die Röntgenkristallographie die Struktur der TEV-Protease gelöst. Sie besteht aus zwei β-Fässern und einem flexiblen C-terminalen Schwanz und hat strukturelle Homologie mit der Chymotrypsin-Superfamilie der Proteasen (PA-Familie, C4-Familie klassifiziert von MEROPS). Obwohl die TEV-Protease homolog zu zellulären Serin-Proteasen (wie Trypsin, Elastase, Thrombin usw.) ist, verwendet sie Cystein als ihren katalytischen Nucleophil (wie viele andere virale Proteasen). Die kovalente Katalyse erfolgt mit einem Asp-His-Cys-Triplett, das zwischen zwei Fässern getrennt ist (Asp auf β1 und His und Cys auf β2). Die Matrix wird in Form eines Beta-Faltblattes gehalten, das eine antiparallele Wechselwirkung mit den Ritzen zwischen den Fässern und eine parallele Wechselwirkung mit dem Schwanzende des C-Terminals bildet. Daher bildet das Enzym einen Bindungskanal um das Substrat, und Seitenkettenwechselwirkungen steuern die Spezifität.

Abbildung 1. Struktur der TEV-Protease.

Quelle der TEV-Protease

Das Tobacco Etch Virus kodiert sein gesamtes Genom als ein großes Multi-Protein (350 kDa). Es wird von drei Proteasen in funktionale Einheiten gespalten: P1-Protease (1 Spaltstelle), Hilfskomponenten-Protease (1 Spaltstelle) und TEV-Protease (7 Spaltstellen). Die natürliche TEV-Protease enthält auch interne Selbstspaltstellen. Das langsame Schneiden dieser Stelle inaktiviert das Enzym (physiologische Gründe sind unklar).

Anwendungen

Einer der Hauptzwecke dieses Proteins ist die Entfernung von Affinitäts-Tags von gereinigten rekombinanten Fusionsproteinen. Der Grund für die Verwendung von TEV-Protease als biochemisches Werkzeug ist ihre hohe Sequenzspezifität. Wenn die Prioritätssequenz in die flexible Schleife eingefügt wird, ermöglicht diese Spezifität eine kontrollierte Spaltung des Proteins. Da es fast keine erkannten Sequenzen im Protein gibt, macht es es auch relativ ungiftig im Körper. Obwohl das rationale Design nur begrenzten Erfolg bei der Änderung der Proteasenspezifität hatte, wurde die gerichtete Evolution verwendet, um die bevorzugten Reste vor oder nach der Spaltstelle zu ändern. Allerdings hat die TEV-Protease als biochemisches Werkzeug Einschränkungen. Sie wird leicht durch Selbstspaltung (Autolyse) inaktiviert, obwohl sie durch eine einzelne S219V-Mutation an der internen Spaltstelle eliminiert werden kann. Die allein exprimierte Protease ist ebenfalls unlöslich, aber es wurden einige Versuche unternommen, ihre Löslichkeit durch gerichtete Evolution und computergestütztes Design zu verbessern. Es wurde auch gezeigt, dass die Expression durch Fusion mit Maltose-bindendem Protein (MBP), das als löslichkeitserhöhender Partner fungiert, verbessert werden kann. Das Molekulargewicht des Enzyms variiert zwischen 25 und 27 kDa, abhängig von dem verwendeten spezifischen Konstrukt.