TEV-Protease

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Die TEV-Protease ist eine hochspezifische Cysteinprotease, die die Aminosäuresequenz Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser) erkennt und zwischen den Resten Gln und Gly/Ser spaltet. Die TEV-Protease, auch als Tobacco-Etch-Virus-(TEV)-Protease bezeichnet, ist eine hochspezifische Cysteinprotease, die die Aminosäuresequenz Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser) erkennt und zwischen den Resten Gln und Gly/Ser spaltet. Sie wird häufig zur Entfernung von Affinitätsreinigungs-Tags wie Maltose-Bindungsprotein (MBP) oder Polyhistidin von Fusionsproteinen eingesetzt. Die TEV-Protease trägt einen 7xHis-Tag zur einfachen Entfernung aus einer Reaktion mittels Nickel-Affinitätsharzen und wurde gentechnisch so optimiert, dass die thermische Stabilität erhöht und die Autolyse reduziert wird.

Struktur

Derzeit ist die Struktur der TEV-Protease mittels Röntgenkristallographie aufgeklärt. Sie besteht aus zwei β-Fässern (β-Barrels) und einem flexiblen C-terminalen Schwanz und weist eine strukturelle Homologie zur Chymotrypsin-Superfamilie der Proteasen auf (PA-Familie, C4-Familie gemäß MEROPS-Klassifikation). Obwohl die TEV-Protease homolog zu zellulären Serinproteasen (wie Trypsin, Elastase, Thrombin etc.) ist, verwendet sie Cystein als katalytisches Nukleophil (wie viele andere virale Proteasen). Die kovalente Katalyse erfolgt über eine Asp-His-Cys-Triade, die auf zwei Fässer verteilt ist (Asp auf β1 sowie His und Cys auf β2). Die Matrix wird in Form eines β-Faltblatts stabilisiert, das eine antiparallele Wechselwirkung mit den Spalten zwischen den Fässern und eine parallele Wechselwirkung mit dem Endabschnitt des C-Terminus eingeht. Dadurch bildet das Enzym einen Bindungskanal um das Substrat, wobei Seitenketten-Interaktionen die Spezifität steuern.

Abbildung 1. Struktur der TEV-Protease.

Herkunft der TEV-Protease

Das Tobacco-Etch-Virus kodiert sein gesamtes Genom als ein einziges großes Polyprotein (350 kDa). Dieses wird durch drei Proteasen in funktionelle Einheiten gespalten: P1-Protease (1 Spaltstelle), Auxiliary-Component-Protease (1 Spaltstelle) und TEV-Protease (7 Spaltstellen). Die natürliche TEV-Protease enthält zudem interne Selbstspaltstellen. Eine langsame Spaltung an dieser Stelle inaktiviert das Enzym (die physiologischen Gründe sind nicht eindeutig geklärt).

Anwendungen

Einer der Hauptanwendungszwecke dieses Proteins ist die Entfernung von Affinitäts-Tags aus gereinigten rekombinanten Fusionsproteinen. Der Einsatz der TEV-Protease als biochemisches Werkzeug beruht auf ihrer hohen Sequenzspezifität. Wird die Erkennungssequenz in eine flexible Schleife eingefügt, ermöglicht diese Spezifität eine kontrollierte Spaltung des Proteins. Da in Proteinen nahezu keine entsprechenden Erkennungssequenzen vorkommen, gilt sie zudem als relativ wenig toxisch im Organismus. Während das rationale Design nur begrenzten Erfolg bei der Veränderung der Protease-Spezifität hatte, wurde die gerichtete Evolution genutzt, um bevorzugte Reste vor oder nach der Spaltstelle zu verändern. Allerdings weist die TEV-Protease als biochemisches Werkzeug auch Einschränkungen auf. Sie wird leicht durch Selbstspaltung (Autolyse) inaktiviert, was jedoch durch eine einzelne S219V-Mutation an der internen Spaltstelle verhindert werden kann. Allein exprimiert ist die Protease zudem unlöslich; es wurden jedoch Ansätze verfolgt, ihre Löslichkeit durch gerichtete Evolution und computergestütztes Design zu verbessern. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Expression durch Fusion mit Maltose-Bindungsprotein (MBP) verbessert werden kann, das als löslichkeitsfördernder Partner fungiert. Das Molekulargewicht des Enzyms liegt je nach verwendetem Konstrukt zwischen 25 und 27 kDa.