TLN

TLN

Thermolysin ist eine thermostabile neutrale Metalloprotease, die von dem grampositiven Bakterium Proteus thermophilus produziert wird. Ein Zinkion ist für die Enzymaktivität erforderlich, und vier Calciumionen sind für die strukturelle Stabilität notwendig. Thermolysin kann spezifisch die Hydrolyse von Peptidbindungen katalysieren, die hydrophobe Aminosäuren enthalten. Thermolysine werden jedoch auch häufig verwendet, um Peptidbindungen durch die umgekehrte Reaktion der Hydrolyse zu bilden. Thermolysine sind das stabilste Mitglied der Metalloprotease-Familie, die von verschiedenen Bacillus-Arten produziert wird. Diese Enzyme sind auch als "neutrale" Proteasen oder thermolysinähnliche Proteasen (TLN) bekannt.

Synthese

Thermophile Proteasen sind zunächst Pro-Enzyme, die von Bakterien synthetisiert werden. Thermolysin wird als Proenzym synthetisiert, das aus einem 28 Aminosäuren langen Signalpeptid, einem 204 Aminosäuren langen Propeptid und einem 316 Aminosäuren langen reifen Enzym besteht. Das Signalpeptid signalisiert die Translokation von Protohemolysin zur Plasmamembran der Bakterienzellen. Dann wird im Periplasma Prolysin durch Signalpeptidase in Prolysin verarbeitet. Diese Präsequenz fungiert dann als molekularer Chaperon und führt zur automatischen Spaltung der Peptidbindung, die die Präsequenz mit der reifen Sequenz verbindet. Dann wird das reife Protein in das extrazelluläre Medium sezerniert.

Struktur

Das Molekulargewicht von Thermolysin beträgt 34.600 Da. Seine Gesamtstruktur besteht aus zwei grob kugelförmigen Domänen, mit tiefen Rissen, die die Mitte des Moleküls durchqueren und die beiden Domänen trennen. Die Sekundärstruktur jeder Domäne ist ziemlich unterschiedlich. Die N-terminale Domäne besteht hauptsächlich aus β-Faltblättern, während die Struktur der C-terminalen Domäne größtenteils α-Helix ist. Die beiden Domänen sind durch eine zentrale Alpha-Helix verbunden, die die Aminosäuren 137-151 überspannt. Im Gegensatz zu vielen Proteinen, die während der Erwärmung und Denaturierung konformationale Änderungen durchlaufen, erfährt Thermolysin bis mindestens 70 °C keine wesentlichen konformationalen Änderungen.

Eigenschaften von TLN

Die thermische Stabilität der Mitglieder der TLN-Serie wird durch die T50-Temperatur gemessen. Eine Inkubation bei dieser Temperatur für 30 Minuten reduziert die Enzymaktivität um die Hälfte. Der T50-Wert von Thermolysin beträgt 86,9 °C, was es zum thermisch stabilsten Mitglied der TLN-Serie macht. Forschungen zum Beitrag von Calcium zur Stabilität von Plasmin zeigen, dass nach der Wärmeinaktivierung ein einzelnes Calciumion im Molekül freigesetzt wird. Durch die Veränderung der Bindungsstelle, um zu verhindern, dass das Calcium zunächst an das Molekül bindet, wird die Stabilität von Thermolysin um 7 °C verringert. Obwohl die Calciumbindung eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung von Thermophilinen spielt, ist für die Stabilität eine kleine Gruppe von Aminosäuren der N-terminalen Domäne, die sich an der Oberfläche des Proteins befindet, entscheidender. Insbesondere hat Phenylalanin (F) an der Aminosäureposition 63 und Prolin (P) an der Aminosäureposition 69 einen signifikanten Beitrag zur Stabilität des wärmelöslichen Proteins. Bei instabilen thermophilinähnlichen Proteasen, die von Bacillus stearothermophilus (TLN-ste) produziert werden, wurden diese Aminosäuren in Threonin (T) und Alanin (A) geändert, was zu einer verringerten Stabilität um 7 °C (F63→T) und 6,3 °C (P69→A) führte, die Stabilität verringert sich um 12,3 °C.

Referenz