TLN

TLN

Thermolysin ist eine thermostabile, neutrale Metalloprotease, die vom grampositiven Bakterium Proteus thermophilus produziert wird. Für die Enzymaktivität ist ein Zinkion erforderlich, und für die strukturelle Stabilität werden vier Calciumionen benötigt. Thermolysin katalysiert spezifisch die Hydrolyse von Peptidbindungen, die hydrophobe Aminosäuren enthalten. Thermolysine werden jedoch auch breit eingesetzt, um über die Umkehrreaktion der Hydrolyse Peptidbindungen zu bilden. Thermolysine sind die stabilsten Vertreter der von verschiedenen Bacillus-Spezies produzierten Metalloprotease-Familie. Diese Enzyme sind auch als „neutrale“ Proteasen bzw. thermolysinähnliche Proteasen (TLN) bekannt.

Synthese

Thermophile Proteasen werden von Bakterien zunächst als Proenzyme synthetisiert. Thermolysin wird als Proenzym gebildet, das aus einem 28 Aminosäuren langen Signalpeptid, einem 204 Aminosäuren langen Propeptid und einem 316 Aminosäuren langen reifen Enzym besteht. Das Signalpeptid vermittelt die Translokation von Protohämolysin zur Plasmamembran bakterieller Zellen. Anschließend wird im Periplasma Prolysin durch eine Signalpeptidase prozessiert. Diese Präsequenz wirkt danach als molekulares Chaperon und führt zur autokatalytischen Spaltung der Peptidbindung zwischen Präsequenz und reifer Sequenz. Danach wird das reife Protein in das extrazelluläre Medium sezerniert.

Struktur

Die Molekülmasse von Thermolysin beträgt 34.600 Da. Die Gesamtstruktur besteht aus zwei annähernd sphärischen Domänen; tiefe Spalten verlaufen durch die Mitte des Moleküls und trennen die beiden Domänen. Die Sekundärstruktur der jeweiligen Domänen unterscheidet sich deutlich. Die N‑terminale Domäne besteht überwiegend aus β‑Faltblättern, während die C‑terminale Domäne größtenteils α‑helikal aufgebaut ist. Beide Domänen sind über eine zentrale α‑Helix verbunden, die die Aminosäuren 137–151 umfasst. Im Gegensatz zu vielen Proteinen, die bei Erwärmung und Denaturierung Konformationsänderungen durchlaufen, zeigt Thermolysin bis mindestens 70 °C keine wesentlichen Konformationsänderungen.

Eigenschaften von TLN

Die thermische Stabilität der Mitglieder der TLN‑Serie wird über die T50‑Temperatur bestimmt. Eine Inkubation bei dieser Temperatur über 30 Minuten reduziert die Enzymaktivität um die Hälfte. Der T50‑Wert von Thermolysin beträgt 86,9 °C und macht es zum thermisch stabilsten Mitglied der TLN‑Serie. Untersuchungen zum Beitrag von Calcium zur Stabilität von Plasmin zeigen, dass nach thermischer Inaktivierung ein einzelnes Calciumion aus dem Molekül freigesetzt wird. Wird die Bindungsstelle so verändert, dass Calcium initial nicht an das Molekül binden kann, verringert sich die Stabilität von Thermolysin um 7 °C. Obwohl die Calciumbindung eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung von Thermolysinen spielt, ist für die Stabilität noch entscheidender ein kleiner Cluster von Aminosäuren der N‑terminalen Domäne, der sich auf der Proteinoberfläche befindet. Insbesondere Phenylalanin (F) an Aminosäureposition 63 und Prolin (P) an Aminosäureposition 69 tragen wesentlich zur Stabilität des hitzestabilen Proteins bei. In instabilen thermolysinähnlichen Proteasen aus Bacillus stearothermophilus (TLN‑ste) wurden diese Aminosäuren jeweils zu Threonin (T) bzw. Alanin (A) verändert, was zu einer verminderten Stabilität um 7 °C (F63→T) bzw. 6,3 °C (P69→A) führte; insgesamt sinkt die Stabilität um 12,3 °C.

Referenz