tPA

tPA

Der Gewebeplasminogenaktivator (tPA, tissue plasminogen activator) ist eine Serinprotease, die auf Endothelzellen (in Blutgefäßen lokalisierte Zellen) vorkommt und am Abbau von Blutgerinnseln (über Plasmin) beteiligt ist. Das tPA-Enzym katalysiert die Umwandlung von Plasminogen zu Plasmin. tPA kann in der Forschung zu embolischem oder thrombotischem Schlaganfall eingesetzt werden. TPA kann mittels rekombinanter Biotechnologie hergestellt werden. Das auf diese Weise erzeugte tPA wird als rekombinanter Gewebeplasminogenaktivator (rtPA) bezeichnet.

Abbildung 1. Proteinstruktur von tPA.

Einleitung

Die Blutgerinnung ist ein enzymatischer Prozess, der durch Material aus geschädigtem Gewebe ausgelöst wird und letztlich zur Bildung eines Fibrinmonomers führt, das ein Gerinnsel ausbildet. Nach einigen Tagen wird das Fibringerinnsel durch das fibrinolytische Enzymsystem abgebaut. Die zentrale Enzymkomponente dieses Systems ist das in Plasma und den meisten extravasalen Flüssigkeiten vorhandene Glykoprotein Plasminogen. Plasminogen ist ein Zymogen einer Serinprotease und wird nach partieller Spaltung durch einen Plasminogenaktivator in seine aktive Form, Plasmin, überführt. Im menschlichen Körper wurden zwei Plasminogenaktivatoren identifiziert, nämlich der Gewebe-Typ-Plasminogenaktivator (t-PA) und der Urokinase-Typ-Aktivator (u-PA). t-PA ist der Hauptaktivator von Plasminogen im Blut, während u-PA eine wesentliche Funktion in der gewebebezogenen Proteolyse hat und bei der Entfernung intravasalen Fibrins nach t-PA an zweiter Stelle steht. Die Fibrinolyse wird überwiegend an der Fibrinoberfläche initiiert und fortgeleitet. Die Fibrinoberfläche stellt Bindungsstellen bereit, um die zahlreichen Komponenten des fibrinolytischen Systems (insbesondere Plasminogen und t-PA) optimal zu rekrutieren. Dieser stimulierende Effekt stellt sicher, dass die Konzentration von Plasminogen und t-PA an den Fibrinablagerungen hoch ist, und ermöglicht die Lokalisation der Plasminaktivität. Der Plasminogenaktivator-Inhibitor-1 (PAI-1) sowie Plasmininhibitoren vermitteln eine inhibitorische Regulation. PAI-1 ist der wirksamste t-PA-Inhibitor im Plasma, und der überwiegende Anteil des zirkulierenden t-PA liegt an diesen Inhibitor gebunden vor.

Struktur

Humanes t-PA ist eine 68-kDa-Serinprotease, die aus 530 bzw. 527 Aminosäuren besteht und 7 % bis 13 % Kohlenhydrate enthält. Das Molekül setzt sich aus fünf unterschiedlichen Domänenstrukturen mit autonomen Funktionen zusammen. Die Finger-Domäne und zwei Kringle-Domänen sind an der Bindung von t-PA an Fibrin beteiligt, während die epidermale Wachstumsfaktor(EGF)-Domäne an der raschen hepatischen Clearance beteiligt ist. Die Serinprotease-Domäne enthält ein aktives Zentrum, das aus Serin, Histidin und Asparaginsäure besteht, die in der Primärstruktur relativ weit voneinander entfernt sind, in der gefalteten Proteinstruktur jedoch räumlich eng beieinanderliegen. Dieses Zentrum spaltet die Arg561-Val562-Bindung in Plasminogen und aktiviert es dadurch zu Plasmin.

Synthese und Sekretion

t-PA wird hauptsächlich in vaskulären Endothelzellen synthetisiert und kontinuierlich in das Plasma sezerniert; zusätzlich kann es zu einer akuten Freisetzung von t-PA kommen. Letzteres tritt bei Stimulation bestimmter Endothelzellrezeptoren auf. Unterschiedliche Bereiche des Gefäßsystems sezernieren unterschiedliche Mengen an t-PA. Die t-PA-Sekretion in der oberen Extremität ist viermal so hoch wie in der unteren Extremität. Es existieren zwei Formen von t-PA: einkettiges t-PA (sct-PA) und zweikettiges t-PA (tct-PA). Einkettige Moleküle sind die natürliche Form von t-PA, die von Endothelzellen sezerniert wird, während zweikettige Formen durch die proteolytische Aktivität von Plasmin entstehen. Beide Formen sind katalytisch aktiv und weisen in Anwesenheit von Fibrin ähnliche enzymatische Eigenschaften auf.

Regulation

Die Interaktion zwischen t-PA und PAI-1 sowie ihr gemeinsames Auftreten im Plasma sind komplex. Die Gesamtmenge an t-PA- und PAI-1-Antigen im Plasma zeigt in der Regel eine starke positive Korrelation, was darauf hindeutet, dass Synthese und Clearance von t-PA und PAI-1 biologisch gekoppelt sind. Ein Anstieg der PAI-1-Spiegel führt jedoch zu einer erhöhten t-PA-Produktion, was nicht automatisch eine Zunahme des Anteils an aktivem t-PA bedeutet. Im Gegensatz dazu scheint die t-PA-Aktivität invers mit PAI-1- und t-PA-Antigenen zusammenzuhängen. Da eine Zunahme der Gesamtmenge an t-PA mit einer Abnahme der t-PA-Aktivität einhergeht, wirkt diese Korrelation zunächst widersprüchlich.

t-PA-Analytikmethoden

Es wurden verschiedene Methoden zur Bestimmung von t-PA-Spiegeln im humanen Plasma beschrieben. Diese lassen sich in spezifische t-PA-Nachweisverfahren und unspezifische globale Nachweisverfahren unterteilen. Zwei heute gebräuchliche Methoden sind die Bestimmung der Lysezeit von Gesamtglobulin-Gerinnseln sowie der Fibrinplatten-Test. Die spezifische t-PA-Analytik umfasst immunologische Methoden zur Messung des t-PA-Antigens (d. h. freies t-PA sowie t-PA/PAI-1-Komplexe) und funktionelle Methoden. Letztere sind entweder ein chromogener Assay unter Verwendung eines chromogenen Plasminsubstrats und eines Aktivators oder ein biologischer Immunoassay, der eine Kombination aus monoklonalen Antikörpern und einem chromogenen Plasminsubstrat verwendet.

Literatur