Transferase

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Fast alle DNA-Polymerasen, die bislang charakterisiert wurden, verwenden DNA oder RNA als Matrize, um jedes einzelne Inkorporationsereignis zu steuern, und katalysieren dabei spezifisch die Integration von Mononukleotiden in den wachsenden Primer. Es gibt jedoch eine einzigartige DNA-Polymerase, die als terminale Desoxynukleotidyltransferase (TdT) bezeichnet wird und ausschließlich einzelsträngige DNA als Substrat nutzt. TdT besitzt die besondere Fähigkeit, genomisches Material de novo zu erzeugen, was sie zu einer der attraktivsten DNA-Polymerasen für Wissenschaftler macht. Obwohl TdT bei Säugetieren sehr früh identifiziert wurde, gehört sie nach wie vor zu den am wenigsten verstandenen Enzymen, die die DNA-Synthese katalysieren.

Abb. 1. Der katalytische Prozess von TdT (Deshpande, S.; et al. 2019)

In den vergangenen Jahrzehnten wurden verschiedene mRNA-Spleißvarianten dieses Enzyms bei Rindern, Mäusen und Menschen identifiziert und umfassend untersucht. Bislang wurden bei Mäusen zwei TdT-Spleißvarianten beobachtet, während bei Rindern und Menschen jeweils drei beschrieben sind.

Bei Mäusen sind die zwei identifizierten Spleißvarianten von TdT TdTS (eine kurze Form mit 509 Aminosäuren) und TdTL (eine lange Form mit 529 Resten). TdTS katalysiert die unvoreingenommene, nicht matrizenabhängige Addition von Nukleotiden an das Antigenrezeptor-Gen, während TdTL eine 3'→5'-Exonukleaseaktivität aufweist. Andere gehen jedoch davon aus, dass TdTL keine Exonukleaseaktivität besitzt und in vitro nahezu die gleiche enzymatische Aktivität wie TdTS zeigt. Obwohl der Mechanismus dieser Regulation noch nicht geklärt ist, deuten diese Daten darauf hin, dass die Funktion der beiden murinen TdT-Isoformen darin besteht, die Diversität des Antigenrepertoires auszubalancieren, um die Integrität der variablen Region des Antigenrezeptors zu erhalten. Die humanen (h) und bovinen (b) TdT-Isoformen sind komplexer, da jeweils drei alternative Spleißvarianten existieren, die als TdTS (kurz), TdTL1 (lang) und TdTL2 (lang) bezeichnet werden.

Herkunft und Aufreinigung von TdT

TdT wurde erstmals 1971 aus Thymusdrüsen von Kälbern aufgereinigt. Zunächst wurde das isolierte Protein als proteolysierte Form angesehen, die zwei Peptide enthielt, welche ursprünglich als Heterodimer aus α- und β-Untereinheiten identifiziert wurden. Nachfolgende Studien bestätigten jedoch, dass TdT ein monomeres Protein mit einem Molekulargewicht von 58.000 bis 60.000 Dalton ist. Da es jedoch leicht hydrolysiert wird, ist es sehr schwierig, ein intaktes und hochaktives Enzym zu gewinnen. Große Mengen TdT können aus kultivierten Zelllinien aufgereinigt werden, die aus Patienten mit akuter lymphoblastischer Leukämie etabliert wurden. Dieses Verfahren ist jedoch für eine Massenproduktion zu kostenintensiv. Derzeit wird TdT überwiegend mittels Säulenchromatographie bis zur Homogenität aufgereinigt; dies wird durch Anbringen eines Hexahistidin-Tags am N-Terminus erreicht, der die enzymatische Aktivität nicht beeinträchtigt. Rekombinante humane TdT wurde erfolgreich im Baculovirus-Expressionssystem überexprimiert und in einem Schritt aus Trichoplusia ni-Larven mittels monoklonaler Antikörper-Affinitätschromatographie bis zur Homogenität gereinigt. Dieser Fortschritt spielte eine unverzichtbare Rolle bei der Bereitstellung großer Proteinmengen, die für die strukturelle Charakterisierung von TdT erforderlich sind.

Abb. 2. Strukturen der Maus-TdT (Loc’h, J.; et al. 2016)

Metallionennutzung

Es ist allgemein bekannt, dass alle DNA-Polymerasen für die Katalyse der mit der Nukleotidinkorporation verbundenen Phosphoryltransferreaktion die Anwesenheit zweiwertiger Metallionen benötigen. In diesem Mechanismus dient ein Aspartatrest in der Nähe des Desoxyribose-Zuckers des eintretenden dNTP als allgemeine Base, um das Proton von der 3′-OH-Gruppe zu abstrahieren und so ein reaktiveres Nukleophil zu erzeugen. In ähnlicher Weise benötigen terminale Transferasen – wie alle DNA-Polymerasen – ebenfalls zweiwertige Metallionen für die Katalyse. Im Unterschied zu anderen Enzymen ist TdT einzigartig in ihrer Fähigkeit, mehrere zweiwertige Kationen wie Co²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺ und Mg²⁺ zu nutzen. Im Allgemeinen ist in Anwesenheit zweiwertiger Metallionen die Verlängerungsrate des Primers p(dA)n (wobei n die Kettenlänge von 4 bis 50 angibt) mit dATP in folgender Reihenfolge angeordnet: Mg²⁺> Zn²⁺> Co²⁺> Mn²⁺. Darüber hinaus hat jedes Metallion einen unterschiedlichen Einfluss auf die Kinetik der Nukleotidinkorporation. So fördert Mg²⁺ die bevorzugte Nutzung von dATP und dGTP, während Co²⁺ die katalytische Polymerisationseffizienz von Pyrimidinen, dTTP und dCTP verbessert. 

Biomedizinische Anwendungen von TdT

Eine Vielzahl von Evidenzen zeigt, dass Veränderungen der TdT-Aktivität bzw. des Expressionsniveaus eine wichtige Rolle bei Entstehung und Progression von Krebserkrankungen sowie bei bestimmten chemischen Reaktionen spielen. Die meisten Patienten mit akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL) der B- und T-Zell-Linie zeigen unterschiedliche TdT-Expressionsniveaus und mehrere TdT-Subtypen in ihren Blasten. Zudem sind höhere TdT-Aktivitätsniveaus eng mit einer ungünstigen Prognose assoziiert und führen letztlich zu einer verkürzten Überlebenszeit. Diese Erkenntnisse haben die Entwicklung TdT-selektiver Inhibitoren vorangetrieben, die als Chemotherapeutika bei den entsprechenden Leukämien eingesetzt werden können. Beispielsweise ist das Nukleosidanalogon Cordycepin (3'-Desoxyadenosin) zytotoxisch gegenüber terminaltransferase-positiven Leukämiezellen, insbesondere in Kombination mit dem Adenosindesaminase-Inhibitor Deoxycoformycin. Dieses Analogon wurde jedoch aufgrund seiner Nebenwirkungen nicht breit eingesetzt. Neuere Studien berichten, dass bestimmte Aryldiketohexensäuren die katalytische Aktivität von TdT und Polλ hemmen können, ohne als Kettenabbrecher zu wirken, und eine starke Zytotoxizität gegenüber TdT-positiven Leukämiezelllinien (Molt4) zeigen.

TdT kann als Biokatalysator eingesetzt werden, um die 3'-Termini synthetischer Oligonukleotide mit Radionukleotiden oder unterschiedlichen Fluoreszenzsonden zu markieren. Diese markierten Primer können anschließend an den komplementären Strang annealiert und als radioaktives Substrat zur Überwachung der Aktivitäten von Enzymen des Nukleinsäurestoffwechsels verwendet werden, darunter Restriktionsendonukleasen, matrizenabhängige DNA-Polymerasen und DNA-Glykosylasen.