Transferase

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Beinahe alle charakterisierten DNA-Polymerasen verwenden DNA oder RNA als Matrizen, um jedes Integrationsereignis zu leiten, und katalysieren spezifisch die Integration von Mononukleotiden in den Wachstumsprimer. Es gibt jedoch eine einzigartige DNA-Polymerase namens terminale Deoxynukleotidyltransferase (TdT), die ausschließlich einzelsträngige DNA als Substrat verwendet. TdT hat die einzigartige Fähigkeit, genomisches Material de novo zu erzeugen, was sie zu einer der attraktivsten DNA-Polymerasen für Wissenschaftler macht. Obwohl TdT sehr früh bei Säugetieren identifiziert wurde, ist sie immer noch eines der am wenigsten verstandenen Enzyme, die die DNA-Synthese katalysieren.

Abb. 1. Der katalytische Prozess von TdT (Deshpande, S.; et al. 2019)

In den letzten Jahrzehnten wurden verschiedene mRNA-Spleißvarianten dieses Enzyms identifiziert und umfassend bei Rindern, Mäusen und Menschen untersucht. Bisher wurden zwei TdT-Spleißvarianten bei Mäusen beobachtet, während Rinder und Menschen jeweils drei haben.

Bei Mäusen sind die beiden identifizierten Spleißvarianten von TdT TdTS (eine kurze Form mit 509 Aminosäuren) und TdTL (eine lange Form mit 529 Resten). TDTS katalysiert die unvoreingenommene und nicht-templated Hinzufügung von Nukleotiden zum Antigenrezeptor-Gen, während TdTL eine 3'→5' Exonuklease-Aktivität aufweist. Andere glauben jedoch, dass TdTL keine Exonuklease-Enzymaktivität hat und fast die gleiche enzymatische Aktivität wie TDTS in vitro zeigt. Obwohl der Mechanismus dieser Regulation noch nicht klar ist, deuten diese Daten darauf hin, dass die Funktion der beiden TdT-murinen Isoformen darin besteht, die Diversität des Antigenrepertoires auszugleichen, um die Integrität des variablen Bereichs des Antigenrezeptors aufrechtzuerhalten. Die menschlichen (h) und bovinen (b) TdT-Isoformen sind komplizierter, da jede drei alternative Spleißvarianten hat, die TdTS (kurz), TdTL1 (lang) und TdTL2 (lang) genannt werden.

Quelle und Reinigung von TdT

TdT wurde erstmals 1971 aus Kalb-Thymusdrüsen isoliert. Zunächst wurde das isolierte Protein als proteolysierte Form betrachtet, die zwei Peptide enthielt, die ursprünglich als Heterodimer von α- und β-Untereinheiten identifiziert wurden. Spätere Studien bestätigten jedoch, dass TdT ein monomeres Protein mit einem Molekulargewicht von 58.000 bis 60.000 Dalton ist. Da es jedoch leicht hydrolysiert wird, wird es sehr schwierig, ein intaktes und hochaktives Enzym zu erhalten. Große Mengen TdT können aus kultivierten Zelllinien, die von Patienten mit akuter lymphoblastischer Leukämie propagiert werden, gereinigt werden. Diese Methode ist jedoch zu teuer für die Massenproduktion. Derzeit wird TdT hauptsächlich in eine homogene Form durch Säulenchromatographie gereinigt, was durch das Anbringen eines Hexahistidin-Tags am N-Terminus erreicht wird, das seine enzymatische Aktivität nicht beeinträchtigt. Rekombinante menschliche TdT wurde erfolgreich im Baculovirus-Expressionssystem überexprimiert und in einem Schritt aus Trichoplusia ni-Larven unter Verwendung einer monoklonalen Antikörper-Affinitäts-Säule gereinigt. Dieser Fortschritt spielte eine unverzichtbare Rolle bei der Erzeugung einer großen Anzahl von Proteinen, die für die strukturelle Charakterisierung von TdT erforderlich sind.

Abb. 2. Strukturen von Maus TdT (Loc’h, J.; et al. 2016)

Metallnutzung

Es ist allgemein bekannt, dass alle DNA-Polymerasen die Anwesenheit von zweiwertigen Metallionen benötigen, um die phosphoryltransferreaktion zu katalysieren, die mit der Nukleotidinkorporation verbunden ist. In diesem Mechanismus dient ein Aspartatrest in der Nähe des Desoxyribosezuckers des eingehenden dNTP als allgemeine Base, um das Proton von der 3′-OH-Gruppe abzuziehen, um einen reaktiveren Nucleophil zu erzeugen. Ähnlich benötigen terminale Transferasen, wie alle DNA-Polymerasen, ebenfalls zweiwertige Metallionen für die Katalyse. Im Gegensatz zu anderen Enzymen ist TdT einzigartig in ihrer Fähigkeit, mehrere zweiwertige Kationen wie Co²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺ und Mg²⁺ zu verwenden. Im Allgemeinen ist die Verlängerungsrate des Primers p(dA)n (wobei n die Kettenlänge von 4 bis 50 ist) mit dATP in folgender Reihenfolge angeordnet: Mg²⁺> Zn²⁺> Co²⁺> Mn²⁺. Darüber hinaus hat jedes Metallion einen unterschiedlichen Einfluss auf die Kinetik der Nukleotidinkorporation. Zum Beispiel fördert Mg²⁺ die bevorzugte Nutzung von dATP und dGTP, während Co²⁺ die katalytische Polymerisationseffizienz von Pyrimidinen, dTTP und dCTP verbessert. 

Biomedizinische Anwendungen von TdT

Eine große Menge an Beweisen zeigt, dass Veränderungen in der Aktivität/Expressionsniveau von TdT eine wichtige Rolle bei der Entstehung und Entwicklung von Krebs und einigen chemischen Reaktionen spielen. Die meisten Patienten mit B- und T-Zell-akuter lymphatischer Leukämie (ALL) zeigen unterschiedliche Ebenen der TdT-Expression und mehrere TdT-Subtypen in ihren Blastenzellen. Darüber hinaus sind höhere Ebenen der TdT-Aktivität eng mit einer schlechten Prognose verbunden und führen letztendlich zu einer verkürzten Überlebenszeit. Diese Erkenntnisse haben die Entwicklung von TdT-selektiven Inhibitoren vorangetrieben, die als Chemotherapeutika für diese verwandten Leukämien eingesetzt werden können. Zum Beispiel ist der Nukleosid-Analog Cordycepin (3'-Deoxyadenosin) zytotoxisch für terminale Transferase-positive Leukämiezellen, insbesondere wenn er in Kombination mit dem Adenosindeaminase-Inhibitor Deoxycoformycin verwendet wird. Dieser Analog wurde jedoch aufgrund seiner Nebenwirkungen nicht weit verbreitet eingesetzt. Jüngste Studien haben berichtet, dass bestimmte Aryldiketo-Hexensäuren die katalytische Aktivität von TdT und polλ hemmen können, ohne als Kettenbeender zu wirken, und zeigen eine starke Zytotoxizität gegenüber TdT-positiven Leukämiezelllinien (Molt4).

TdT kann als Biokatalysator verwendet werden, um die 3'-Enden von synthetischen Oligonukleotiden mit Radionukleotiden oder verschiedenen fluoreszierenden Sonden zu markieren, und dann können diese markierten Primer an den komplementären Strang annealiert und als radioaktives Substrat zur Überwachung der Aktivitäten von Enzymen, die am Nukleinsäuremetabolismus beteiligt sind, verwendet werden, einschließlich Restriktionsendonukleasen, templatedependent DNA-Polymerasen und DNA-Glykosylasen.