Urease

Urease (EC 3.5.1.5) gehört zu den Hydrolasen, ist ein Mitglied der Amidohydrolasen und Phosphotriesterasen Superfamilie. Der systematische Name von Urease ist Urea-Amidohydrolase, ein nickelhaltiges Enzym. Urease ist ein Metalloenzym und wurde in Pflanzen, Pilzen und Bakterien gefunden, jedoch nicht in Tieren. Urease trägt zwei Ni²⁺-Ionen in ihren aktiven Stellen und katalysiert die Hydrolyse von Urea zur Produktion von Ammoniak und Carbamat. Urease hat zwei wichtige historische Bedeutungen in der Biochemie. Erstens zeigte die Kristallisation von Urease die proteinartige Natur von Enzymen. Zweitens wurde die biologische Bedeutung von Nickel erkannt.

Struktur

X-ray-Kristallographie-Studien haben gezeigt, dass sowohl Pflanzen- als auch Bakterien-Ureas eine gemeinsame trimerische Struktur teilen, aber die Anzahl der Polypeptidketten, die Monomere oder funktionale Einheiten bilden, unterschiedlich ist. Die funktionale Einheit der Pflanzen- und Pilz-Ureas ist eine einzelne Polypeptidkette (α), während die funktionale Einheit der bakteriellen Ureas aus zwei (α und β, nur in Helicobacter gefunden) oder drei (α, β und γ) Polypeptidketten besteht. Die häufigste Struktur der Pflanzen-Ureas ist ein Dimer von Trimeren (α₃)₂, einige Pflanzen- und Pilz-Ureas sind dimerisch/trimerisch/tetramerisch. Bakterielle Ureas sind Trimere (αβγ)3, die Urease von Helicobacter pylori ist ein Tetramer von Trimeren von Dimeren ([αβ]₃)₄. Die Aminosäuresequenz der kleineren Untereinheit der pronukleären Urease ist kollinear mit dem entsprechenden Bereich in der Einzelkette der eukaryotischen Urease.

Abbildung 1. Struktur der Ureas. (Kappaun K. 2018)

Katalytischer Mechanismus

Die aktive Stelle der Ureas besteht aus zwei Nickelatomen, einer carbamoylierten Lysin, vier Histidinen und einem Aspartat-Rest. Die carbamoylierte Lysinbrücke verbindet zwei Nickelatome, Ni(1) koordiniert von zwei Histidinen, und Ni(2) koordiniert von den anderen zwei Histidinen und einem Aspartat-Rest. Die Hydroxidionbrücke verbindet die beiden Ni-Atome und bildet zusammen mit den anderen drei terminalen Wassermolekülen einen wasserstoffbrückenverknüpften tetrahedralen Cluster in der aktiven Stelle. Während seiner katalytischen Reaktion ersetzt Urea zuerst die drei Wassermoleküle an der aktiven Stelle und verbindet sich dann über seinen Carbonylsauerstoff mit Ni(1), wodurch das Urea-Carbon elektrophiler und anfälliger für nucleophile Angriffe wird. Urea verbindet sich dann über sein Amino-Stickstoffatom mit Ni(2), um eine bidentate Bindung mit Ureas zu bilden. Diese Kombination fördert den nucleophilen Angriff des Carbonylkohlenstoffs durch das Wassermolekül, um ein tetraedrisches Zwischenprodukt zu bilden, aus dem NH₃ und Carbamat freigesetzt werden.

Abbildung 2. Katalytischer Mechanismus der Ureas. (Kappaun K. 2018)

Aktivierung der Urease

Um ureolytische Aktivität zu erreichen, muss die aktive Stelle der Urease mit Nickelionen versehen werden und erfordert auch die Carbamoylierung ihres Lysinrests. In Bakterien sind vier Hilfsproteine (UreD, UreF, UreG und UreE) an der Assemblierung der aktiven Metallzentren der Urease beteiligt. Die Aktivierung der Urease beginnt mit UreD, dem ersten Protein, das an Apo-Urease-Oligomeren als Gerüst für die Bildung des Aktivierungs-Komplexes bindet. UreF bindet dann an (UreABC–UreD)₃ und fungiert als GTPase-aktivierendes Protein. Schließlich vervollständigt die Kombination mit UreG die Bildung des Komplexes. UreG ist ein intrinsisch ungeordnetes Enzym, das als GTPase fungiert, um Energie für den Reifungsprozess der Urease bereitzustellen. Wenn GTP hydrolysiert wird, liefert der Nickel-bindende Chaperon UreE Metallionen an (UreABC–UreD)₃. Dieses Aktivierungsmodell wurde mit dem Anstieg der strukturellen Informationen über das Hilfsprotein der Urease weiter verbessert. Im neuen Aktivierungsmodell bindet UreE, kombiniert mit Ni²⁺, Apo-UreG, um die GTP-Aufnahme durch UreG zu fördern, und Ni²⁺ wird von UreE zu UreG transloziert. Der (UreDF)₂-Komplex konkurriert dann mit UreE um Ni²⁺-UreG, um einen Superkomplex Apo-Urease/Ni²⁺-(UreDFG)₂ zu bilden. Schließlich katalysiert KHCO₃/NH₄HCO₃ die Hydrolyse von GTP durch UreG, um die Aktivierung der Urease abzuschließen.

Inhibitoren der Ureas

Es gibt zwei Hauptziele für das Studium der Inhibitoren der Ureas. Eines ist zu verstehen, wie katalytische Stellen funktionieren, und das andere ist, effektive Inhibitoren zu finden, die die von Ureas katalysierte Urea-Hydrolyse in bestimmten Situationen ausgleichen. Ureas haben eine Vielzahl von Inhibitoren, einschließlich Schwefelverbindungen, Hydroxamine, Phosphorverbindungen, Fluorid, Chinone und Polyphenole. Thiolgruppen hemmen Ureas auf wettbewerbsfähige Weise. Acetohydroxamsäure ist ein langsam bindender wettbewerbsfähiger Inhibitor der Ureas, der zur Reduzierung von Harnsteinen und zur Behandlung von Harnwegsinfektionen verwendet werden kann. Derivate der Phosphorsäure und Phosphorothioate sind potente Inhibitoren der Urease. Phosphat ist ein pH-abhängiger wettbewerbsfähiger Inhibitor der Urease mit einem pH-Bereich von 5,0-8,0, aber vernachlässigbar bei pH-Werten über 7,5-8,0. Fluorid ist ebenfalls ein pH-empfindlicher Inhibitor. Studien zu Chinonen haben einen allgemeinen langsam bindenden konzentrationsabhängigen Mechanismus gezeigt. Chinone hemmen Ureas durch kovalente Modifikation des konservierten Cysteinrests in der aktiven Stelle, auch durch Arylation und Oxidation ihrer Thiolgruppen.

Anwendungen

Urease ermöglicht es Mikroorganismen, Urea als ihre einzige Stickstoffquelle zu nutzen. Die Synthese von Urease ist konstitutiv oder wird als bakterielle stressbezogene Reaktion synthetisiert, um niedrigen Umgebungs-pH auszugleichen. Die Urease der menschlichen Darmmikrobiota hydrolysiert bis zu 30% des gesamten Ureas, das in unserem Körper produziert wird. Mikrobielle Urease ist auch wichtig für die Zahngesundheit. Das Alkali, das durch die Spaltung von Urea durch orale mikrobielle Urease produziert wird, kann die Bildung von Karies und Plaque hemmen. Bei Wiederkäuern wird tierisches Urea im vorderen Magen von bakterieller Urease gespalten, wobei Ammoniak als Stickstoffquelle für die Rumenmikrobiota freigesetzt wird, die wiederum das Tier als Biomasse ernährt.

Referenz