XAO

XAO

Xanthinoxidase ist ein Enzym mit geringer Spezifität, das nicht nur die Umwandlung von Hypoxanthin über Xanthin zu Harnsäure katalysieren kann, sondern auch direkt die Bildung von Harnsäure aus Xanthin. Das FAD-abhängige Sulfid- und Flavin-Enzym kommt in Milch, bei Tieren (insbesondere in Leber und Niere von Vögeln), Insekten sowie Bakterien vor. Xanthinoxidase weist ein Molekulargewicht im Bereich von mehreren Zehntausend bis mehreren Hunderttausend Dalton auf und besitzt eine breite Substratspezifität. Neben Purinderivaten als Elektronendonoren können auch Pteridinderivate und Aldehyde (unter Bildung von Carbonsäuren) als Elektronendonoren dienen. Dabei entstehen Hydroxylverbindungen; die Sauerstoffatome stammen aus Wasser. Für Xanthinoxidase existieren zahlreiche Elektronenakzeptoren, darunter molekularer Sauerstoff, Nitrat, Benzochinon, Nitroverbindungen, NAD, Ferredoxin usw.; dies variiert jedoch je nach Enzymquelle. Während der Reaktion entsteht Peroxid, das Kettenreaktionen auslösen kann.

Abbildung 1. Proteinstruktur von XAO.

Struktur

Das Molekulargewicht der Xanthinoxidase ist relativ hoch (ca. 270.000) und sie enthält zwei FAD-Moleküle, zwei Molybdänatome und acht Eisenatome. Das Molybdän liegt im Enzym als Molybdopterin-Kofaktor vor und stellt das aktive Zentrum des Enzyms dar. Die Eisenatome sind Bestandteil der [2Fe-2S]-Ferredoxin-Eisen-Schwefel-Cluster und sind an Elektronentransferreaktionen beteiligt. Xanthinoxidase ist ein Flavin-Enzym, das in verschiedenen Organismen vorkommt und die Bildung von Harnsäure aus Purinsubstraten im Organismus katalysieren kann. Die Kristallstruktur der Xanthinoxidase wurde aufgeklärt. Sie besteht aus 1.330 Aminosäuren; die Aminosäuresequenz weist zwischen Maus und Mensch eine Homologie von 90 % auf. Das Enzym setzt sich aus zwei vollständig symmetrischen Struktureinheiten zusammen; jede Struktureinheit hat 145 kDa. Das katalytische Zentrum umfasst ein Molybdopterin-Zentrum, zwei Eisen-Schwefel-Zentren sowie Flavin-Adenin-Dinukleotid, wobei das Molybdopterin-Zentrum die entscheidende Stelle für die von Xanthinoxidase katalysierte Umwandlung von Xanthin zu Harnsäure ist.

Katalytischer Mechanismus

Das Molybdänatom des Molybdopterin-Kofaktors im aktiven Zentrum der Xanthinoxidase ist zusätzlich mit einem terminalen Sauerstoff, mehreren Schwefelatomen sowie einer terminalen Hydroxylgruppe verbunden. Bei der Reaktion von Xanthin zu Harnsäure wird zunächst der am Molybdän gebundene Sauerstoff auf das Xanthinmolekül übertragen. Anschließend addiert sich ein Wassermolekül an das aktive Zwischenprodukt, wodurch das aktive Molybdänzentrum regeneriert wird. Analog zu anderen bekannten molybdänhaltigen Redoxenzymen stammen die neu eingeführten Sauerstoffatome im Produkt aus dem Sauerstoff von Wassermolekülen und nicht aus molekularem Sauerstoff.

Anwendung

1. Beteiligung am Nukleinsäurekatabolismus im Organismus

Harnsäure beim Menschen entsteht überwiegend durch den enzymatischen Abbau von Nukleinsäuren und anderen Purinverbindungen, die aus dem Zellstoffwechsel stammen, sowie von Purinen aus der Nahrung. Harnsäure ist das Endprodukt des Katabolismus von Adenin und Guanin, den Bausteinen der Nukleinsäuren, im menschlichen Körper. Hypoxanthin und Xanthin sind direkte Vorstufen der Harnsäure. Unter Einwirkung der Xanthinoxidase wird Hypoxanthin zu Xanthin oxidiert und Xanthin zu Harnsäure.

2. Förderung der Eisenresorption und des Eisentransports

In den Schleimhautzellen des Dünndarms oxidiert Xanthinoxidase aus der Nahrung resorbierte Eisen(II)-Ionen zu Eisen(III)-Ionen, die von Plasma-Transferrin gebunden und über das Blut in verschiedene Gewebe transportiert werden.

3. Bestimmung der Aktivität von SOD (Superoxiddismutase)

In Gegenwart von Sauerstoff kann Xanthinoxidase die Oxidation von Xanthin katalysieren und dabei Harnsäure sowie Sauerstoffradikale erzeugen. Das gebildete Superoxid-Anionenradikal führt zur Oxidation von Hydroxylamin zu Nitrit; dieses zeigt unter Einwirkung des Entwicklers eine purpurrote Färbung, und die Absorption wird mit einem VIS-Spektrophotometer gemessen. Enthält die zu prüfende Probe SOD, wirkt diese spezifisch hemmend auf Superoxid-Anionenradikale, wodurch die Nitritbildung reduziert wird und die Absorption im Messansatz niedriger ausfällt; daraus wird die SOD-Aktivität in der Probe berechnet.

Inhibitor

Die Struktur der Xanthinoxidase ist sehr komplex, sodass zahlreiche Substanzen ihre Aktivität hemmen können. Substanzen wie Purine, Pyrimidine und andere Heterozyklen können mit dem Substrat um die Bindung an das aktive Zentrum des Enzyms konkurrieren (kompetitive Inhibitoren). Verbindungen wie Arsenit, Cyanid und Methanol können mit den Molybdänatomen interagieren und dadurch das Enzym inaktivieren. Weitere Inhibitoren sind Phosphat, Imidazol, Natrium, Kaliumchlorid, Benzoat, Borat, Kupfer, Ascorbinsäure und Dinitrophenol. Die Hemmung durch Ascorbinsäure ist dabei ein indirekter Effekt: Milch enthält zweiwertige Kupferionen, und Ascorbinsäure kann Cu²⁺ zu Cu⁺ reduzieren; Cu⁺ ist ein starker Inhibitor des Enzyms.

Referenz