Alkoholoxidase

Alkoholoxidase (AOX, EC 1.1.3.13) ist ein Flavoenzym, eine Oxidoreduktase, die die Oxidation von Alkoholen zur entsprechenden Carbonylverbindung katalysiert und dabei gleichzeitig Wasserstoffperoxid freisetzt. Der systematische Name dieses Enzyms lautet Alkohol:Oxygen-Oxidoreduktase. Weitere gebräuchliche Bezeichnungen sind Ethanoloxidase und Methanoloxidase. In Abhängigkeit von der Substratspezifität lassen sich Alkoholoxidasen grob in vier Gruppen einteilen: kurzkettige Alkoholoxidase (SCAO), langkettige Alkoholoxidase (LCAO), aromatische Alkoholoxidase (AAO) und sekundäre Alkoholoxidase (SAO). Alkoholoxidasen werden hauptsächlich aus Bakterien, Hefen, Pilzen, Pflanzen, Insekten und Mollusken gewonnen. SCAO und LCAO sind überwiegend intrazellulär, AAO und SAO werden meist in das Medium sezerniert.

Klassifizierung

AOX benötigt einen flavinbasierten Kofaktor, um die Umwandlung von Alkoholen in die entsprechenden Aldehyde oder Ketone zu katalysieren. Das in AOX enthaltene FAD ist eng mit dem Redoxzentrum des Enzyms verknüpft und beteiligt sich an der Übertragung von Hydridionen vom Alkoholsubstrat auf molekularen Sauerstoff, wodurch H₂O₂ entsteht. Die AOX-Aktivität wurde ursprünglich in Polystictus versicolor beschrieben; später isolierten Forschende aus diesem Basidiomyceten ein Enzym, das die Oxidation von Methanol und anderen niederen Alkoholen zu den entsprechenden Aldehyden unter Bildung von H₂O₂ katalysiert. Dieses Enzym wurde anschließend als „Alkoholoxidase“ bezeichnet, bis zum kristallinen Zustand gereinigt, und es wurde festgestellt, dass FAD als prosthetische Gruppe des Enzyms fungiert. Entsprechend der Substratspezifität kann Alkoholoxidase grob in vier Gruppen eingeteilt werden: kurzkettige Alkoholoxidase (SCAO), langkettige Alkoholoxidase (LCAO), aromatische Alkoholoxidase (AAO) und sekundäre Alkoholoxidase (SAO).

Struktur

Wie andere Mitglieder der Glukose-Methanol-Cholin-(GMC)-Oxidoreduktase-Superfamilie enthält Pichia pastoris AOX1 zwei charakteristische Domänen: die FAD-Bindungsdomäne (Aminosäurereste 1–155, 192–306 und 568–663) sowie die Substratbindungsdomäne (Aminosäurereste 156–191 und 307–567). Die am stärksten konservierte Region ist die FAD-Bindungsdomäne; sie umfasst vier Sequenzfragmente, die über die Primärsequenz verteilt sind, mit den charakteristischen Sequenzmotiven der FAD-Nukleotid-Bindungsstelle GXGXXG sowie GGGSSG in P. pastoris AOX1.

Abbildung 1. Die Struktur einer P. pastoris AOX1-Untereinheit. (Koch C. 2016)

Die reife aktive Form von AOX1 ist ein Oligomer aus acht identischen Untereinheiten, von denen jede ein nicht-kovalent gebundenes Flavin-Adenin-Dinukleotid-(FAD)-Molekül als prosthetische Gruppe trägt. Der P. pastoris-AOX1-Kristall ist ein Homo-Oktamer mit einer Größe von etwa 121,8 Å × 133,8 Å × 134,5 Å. Das Oktamer erscheint als Tetramer aus Dimeren, kann jedoch auch als zwei Tetramere beschrieben werden, die einander gegenüberliegen. Die beiden Tetramere interagieren ausschließlich über die Substratbindungsdomänen, während die FAD-Bindungsdomänen die äußere Oberfläche des Oligomers einnehmen. Im Tetramer bildet jedes Monomer mit jeweils zwei benachbarten Untereinheiten 20 Wasserstoffbrückenbindungen und 8 Salzbrücken und nimmt in der paarweisen Interaktion 7 % (1985 Ų) der Kontaktoberfläche ein. Im Gegensatz dazu wird jedes intertetramere Dimer durch umfangreichere Kontakte zwischen den Untereinheiten (40 Wasserstoffbrückenbindungen) stabilisiert, wobei 10 % (2700 Ų) der Kontaktoberfläche vergraben werden. Bei Bildung des Oktamers bildet jedes Monomer etwa 115 Wasserstoffbrückenbindungen und 16 Salzbrücken mit benachbarten Untereinheiten und vergräbt etwa 29 % (8300 Ų) seiner Kontaktoberfläche, was ebenfalls auf die Stabilität des Oktamers hinweist. Die Ausbildung des oligomeren Zustands von AOX1 wird primär durch die Einlagerung zahlreicher Interaktionen zwischen den Monomeren (Aminosäurereste 326–351, 486–548, 247–251, 638–663) begünstigt. Obwohl eine Einlagerung in der Substratbindungsdomäne (367–386) lokalisiert ist und ein Helix-Loop-Helix-Motiv bildet, das von den übrigen Monomeren entfernt liegt und daher an keiner Interaktion zwischen Untereinheiten beteiligt ist, sind die beiden verbleibenden Einlagerungen (326–351, 486–548) an der Bildung der Tetramer- und Dimer-Untereinheiten des AOX1-Oktamers beteiligt. Ihre Länge und inhärente strukturelle Plastizität, kombiniert mit der „face-to-face“-Orientierung der Einheiten, erleichtert die Ausbildung eines breiten Spektrums an Interaktionsnetzwerken, in denen jede Einlagerung gleichzeitig zur Stabilisierung beider Unterassemblierungen beiträgt. Im Gegensatz dazu beteiligen sich die entfernte kurze Schleifenverlängerung (Aminosäurereste 247–251) und die C-terminale Verlängerung der FAD-Bindungsdomäne an der Tetramerbildung ausschließlich über die Interaktion zweier benachbarter Monomere, die an der Bildung des Tetramers beteiligt sind.

Abbildung 2. Die Quartärstruktur von P. pastoris AOX1. (Koch C. 2016)

Katalytischer Mechanismus

Die Analyse der Kristallstruktur von AOX1 zeigte, dass das aktive Zentrum für das Lösungsmittel nicht zugänglich ist. Obwohl das katalytische Zentrum von AOX1 lösungsmittelunzugänglich ist, können an allen aktiven Zentren Elektronendichte-Maxima beobachtet werden, die Wassermolekülen entsprechen. Das Wassermolekül besetzt eine kleine Kavität mit einem Volumen von etwa 135 ų und ist über Wasserstoffbrückenbindungen mit der Seitenkette von Asn616, His567 sowie dem N5-Atom des Isoalloxazinrings verknüpft. Weitere Untersuchungen ergaben, dass die Seitenketten von Phe98 und Met100 strukturelle Elemente sein könnten, die den Eintritt des Substrats in das aktive Zentrum ermöglichen. Das katalytische Zentrum jeder der acht Untereinheiten von AOX1 enthält jeweils ein nicht-kovalent gebundenes FAD-Molekül.

Abbildung 3. Das aktive Zentrum von AOX1. (Koch C. 2016)

Methylotrophe Hefen haben einen Regulationsmechanismus entwickelt, um die Aktivität der Alkoholoxidase feinzujustieren, indem natürlich vorkommende Ribityl-FAD-Anteile automatisch in modifiziertes Arabityl-FAD (a-FAD) umgewandelt werden. a-FAD reduziert V_max geringfügig und senkt den K_m-Wert des Enzyms für das Substrat Methanol deutlich, was physiologisch relevant in Kulturen mit niedrigen Methanolkonzentrationen ist. Da die von AOX katalysierte mehrstufige Reaktion direkt vom Redoxpotenzial des gebundenen Kofaktors abhängt, trägt eine Erhöhung des FAD-Redoxpotenzials zur Gesamtumsetzung des Enzyms bei. Eine Änderung der chiralen Konfiguration am Atom C2' im FAD von AOX führt zur Ausbildung einer neuen intramolekularen Wasserstoffbrückenbindung zwischen der modifizierten a-FAD-Aryl-C2'-OH-Gruppe und dem N1-Atom des Isoalloxazin-Ringsystems, wodurch höchstwahrscheinlich das Redoxpotenzial des FAD-Kofaktors moduliert wird. Die katalytische Oxidationsreaktion beginnt mit der Abspaltung des Hydroxylprotons des Substrats durch eine katalytische Base und der Bildung einer Alkoxid-Spezies, bevor der Hydridtransfer vom α-Kohlenstoff des Substrats erfolgt. Für andere Alkoholoxidasen (AAO, GO, CDH, P2O, PNO) gilt das konservierte Histidin in His/His-, His/Asn- oder His/Pro-Paaren als katalytische Base und trägt daher während der Katalyse eine partielle positive Ladung. His567 in AOX1 wurde als katalytische Base identifiziert, die den Alkohol aktiviert. Die schrittweise von AOX1 katalysierte Reaktion erfordert, dass das Enzym die negative Ladung des Alkoxids durch intermolekulare Wechselwirkungen stabilisiert, die möglicherweise durch zwei konservierte polare Reste, His567 und Asn616, gebildet werden. Dieser Rest befindet sich in einer Wasserstoffbrückenbindung, die vom Alkoxid-Bindungsort entfernt ist. Da der Hydridtransfer über die N5-Position des Isoalloxazinrings erfolgt, kann eine polare Gruppe in unmittelbarer Nähe des N5-Atoms den Übergangszustand stabilisieren. In AOX1 ist der Rest, an dem die OH-Gruppe positioniert ist, Phe98.

Abbildung 4. Modifiziertes a-FAD. (Koch C. 2016)

Literatur