ATP-Sulfurylase

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Einleitung

Sulfatreduzierende Bakterien (SRB) sind an einem der ältesten enzymatischen Stoffwechselwege der Erde beteiligt: der dissimilatorischen Reduktion von Sulfat (SO4^2-) zu Sulfid (S^2-). Unter den SRB können einige Bakterien und Archaeen Sulfat unter aeroben Bedingungen als terminalen Elektronenakzeptor in ihrem Metabolismus nutzen. Sulfit (SO3^2-) fungiert dabei als Zwischenprodukt zur Vermittlung des Reduktionsprozesses von Sulfat. SRB spielen eine wichtige Rolle im biogeochemischen Schwefelkreislauf sowie bei der biologischen Degradation aromatischer Schadstoffe und können als Regulatoren wesentlicher Prozesse in Böden (z. B. Quecksilber-Methylierung usw.) eingesetzt werden.

Der dissimilatorische Reduktionsweg von Sulfat zu anionischem Sulfid umfasst drei zytoplasmatische Enzyme: ATP-Sulfurylase (ATPS), Adenosin-5′-phosphosulfat(APS)-Reduktase (APSR) und dissimilatorische Sulfit-Reduktase (dSIR). ATPS ist dabei für die Bildung der SO4^2--AMP-Bindung verantwortlich und katalysiert die Aktivierung des Sulfatanions zu Adenosin-5′-phosphosulfat (APS). Diese Art der SO4^2--Aktivierung ist erforderlich, da Sulfat ein sehr niedriges Redoxpotenzial aufweist und nicht direkt durch organische Säuren oder molekularen Wasserstoff reduziert werden kann. Das über diesen Stoffwechselweg freigesetzte Sulfid kann Korrosion an metallischen Konstruktionen im Lebensumfeld von SRB verursachen. Im assimilatorischen Stoffwechselweg von Eukaryoten sowie bestimmter Bakterien und Algen ist das APS-Produkt der ATPS-Reaktion das Substrat für die APS-Kinase, die am 3′-Position phosphoryliert und 3′-Phosphoadenosin-5′-phosphosulfat (PAPS) bildet; PAPS dient als Sulfuryl-Donor für zahlreiche schwefelhaltige Verbindungen. PAPS kann zudem zu dem für die Biosynthese von Cystein benötigten Sulfid reduziert werden; Cystein kann wiederum als Schwefel-Donor für Methionin dienen. Bei Metazoa sind die ATPS- und APS-Kinase-Aktivitäten von Pilzen und bestimmten Algen in einem Protein, der PAPS-Synthase, vereint. In Mikroalgen wurden verschiedene ATPS-Isoformen identifiziert; die Diversität der ATPS-Isoformen in Meeresalgen und Süßwasseralgen legt nahe, dass unterschiedliche Sulfatverfügbarkeiten die Evolution der ATPS-Enzyme beeinflussen können.

Kristallstruktur der ATP-Sulfurylase

ATPS ist ein in der Natur ubiquitär vorkommendes Enzym, das unter Verwendung von ATP die reversible Aktivierung von Sulfat katalysiert und dabei APS sowie Pyrophosphat-Anionen bildet. ATPS aus SRB, Hefe und Pflanzen ist jeweils als monomere oder homo-oligomere Struktur charakterisiert. Strukturen des ATPS-APS-Komplexes liegen für folgende Organismen vor: Sojabohne (PDB-Code: 4MAF), Penicillium chrysogenum (PDB-Code: 1I2D), Saccharomyces cerevisiae (PDB-Codes: 1G8H, 1G8G, 1JEE) und Thermus thermophillus (PDB-Code: 1V47). Analog zu Penicillium chrysogenum (PDB-Code: 1I2D) wurde die Quartärstruktur der ATPS aus Saccharomyces cerevisiae (PDB-Code: 1G8H) als homohexamere Assemblierung bestimmt, die aus zwei trimeren Ringen besteht, welche mit einer Verdrehung von 60° übereinander gestapelt sind (Abbildung 1). In der Kristallstruktur der ATP-Sulfurylase werden im aktiven Zentrum vier konservierte Motive beobachtet: QXRN (Gln195-Thr196-Arg197-Asn198), HXXH (His201-Arg202-Ala203-His204), VGRDHAG (Val288-Gly289-Arg290-Asp291-His292-Ala293-Gly294) und PFR (Pro327-Phe328-Arg329).

Abbildung 1. Hexamerstruktur des ATPS-APS-Mg2+-Pyrophosphat-Komplexes, erhalten nach 20 ns Molekulardynamik(MD)-Simulationen; B. Vier konservierte Motive, beobachtet in den bekannten ATPS-Sequenzen, dargestellt in der Kristallstruktur 1G8H (Wójcik-Augustyn, A.; et al. 2019)

Hypothese zur katalytischen Reaktion von ATPS

Die kristallographische Untersuchung der ATPS aus Saccharomyces cerevisiae und Penicillium chrysogenum zeigte, dass die ATP-Bindung eine signifikante Verschiebung in der hexameren ATPS-Struktur verursachen kann. Es wurde festgestellt, dass ATPS ein allosterisches Enzym ist, das mindestens zwei Konformationen einnehmen kann: den R-Zustand mit höherer Substrataffinität und den T-Zustand, der bevorzugt allosterische Inhibitoren bindet. Die ATP-Bindung führt zu einer Verlagerung der Seitenkette von Phe328, wodurch ATPS in den R-Zustand übergeht. Die Faltung von Domäne II, die die Region des aktiven Zentrums enthält, weist darauf hin, dass ATPS zur Superfamilie der α/β-Phosphodiesterasen gehören könnte; die Architektur des Protomers und die unabhängigen Topologien innerhalb einer Proteinkette könnten jedoch auch darauf hindeuten, dass ATPS eine neue α/β-Proteinklasse repräsentiert. Auf Basis von Isotopen-Trapping, Massenspektrometrie und kinetischen Studien der ATPS aus Escherichia coli K12 wurde eine Hypothese zum katalytischen Mechanismus von ATPS formuliert. Die ATPS aus E. coli ist ein Tetramer, das aus Heterodimeren besteht, die durch die Gene cysD und cysN kodiert werden. Isotopen-Trapping-Experimente zeigen, dass die ATPS-Reaktion in E. coli ein GTP-abhängiger Zwei-Schritt-Prozess ist. Zunächst werden das Enzym-AMP-Anhydrid und Pyrophosphat gebildet; nach der Dissoziation des Pyrophosphats tritt das Sulfatanion (SO4^2-) in das aktive Zentrum ein und bildet APS. Es ist jedoch hervorzuheben, dass die Bildung des AMP-Zwischenprodukts GTP-abhängig ist und durch Zugabe von Sulfat gehemmt wird. Die hufeisenförmige Konformation der ATP-Moleküle, modelliert mit SYBYL auf Grundlage der ATPS-APS-PPi-Kristallstruktur aus Saccharomyces cerevisiae, dürfte einen in-line nukleophilen Angriff der Sulfatmoleküle begünstigen.

Abbildung 2. Der für ATPS vorgeschlagene zweistufige SN-1-Reaktionsmechanismus über ein AMP-Anhydrid-Zwischenprodukt (Wójcik-Augustyn, A.; et al. 2019)

Abbildung 3. Der für ATPS vorgeschlagene einstufige SN-2-Reaktionsmechanismus auf Basis der modellierten ATPS-ATP-Sulfat-Struktur (Wójcik-Augustyn, A.; et al. 2019)