Bilirubinoxidase

Bilirubin ist eine Klasse linearer Tetrapyrrol‑Derivate und eines der Metabolite von Eisen‑Porphyrin‑Verbindungen im menschlichen Körper. Bei übermäßiger Bilirubinproduktion oder bei Störungen der hepatozytären Aufnahme, Konjugation und Ausscheidung steigt die Bilirubinkonzentration im Blut an und es kommt zur Hyperbilirubinämie. Daher ist die klinische Bestimmung von Bilirubin für die Detektion hepatobiliärer Erkrankungen, Hämolyse und weiterer assoziierter Krankheitsbilder von hoher Bedeutung. Bilirubinoxidase ist ein häufig eingesetztes Hilfsenzym, das die Oxidation von Bilirubin zu Biliverdin katalysiert und in der In‑vitro‑Diagnostik zur Bestimmung von Serum‑Bilirubin und Gesamtbilirubin verwendet wird. Im Vergleich zu unspezifischen chemischen Methoden ermöglicht sie eine sensitivere Überwachung von Lebererkrankungen, und Serum‑Bilirubinuntersuchungen liefern detailliertere Informationen zur Pathophysiologie des Ikterus.

Struktur

Das Holoenzym der Bilirubinoxidase besteht aus Protein, zweiwertigen Kupferionen und Kohlenhydraten. Das Protein umfasst 17 Aminosäuren ohne Cystein, mit niedrigen Anteilen an Lysin und Methionin sowie hohen Anteilen an Asparaginsäure, Glutaminsäure und Alanin. Der Vorläufer der Bilirubinoxidase setzt sich aus 572 Aminosäureresten zusammen, darunter 534 Aminosäuren und eine 38 Aminosäuren lange Leader‑Sequenz. Die 19 hydrophoben Aminosäuren am C‑Terminus der Leader‑Sequenz ähneln in ihren Eigenschaften bekannten Signalpeptiden und können ebenfalls eine Signalpeptidfunktion erfüllen. Spektralanalysen zeigten, dass zweiwertige Kupferionen an Cys‑, Met‑ und His‑Reste binden können. Die Gensequenz der Bilirubinoxidase ist durch 5 Introns in 6 Exons unterteilt. Alle Intron‑Grenzen sind durch die doppelsträngigen Nukleotidmotive GT und AG gekennzeichnet. Mittels Primer‑Extension‑Analyse wurden vier Transkriptionsstartstellen identifiziert; die Haupt‑Transkriptionsstartstelle liegt 93 Basen stromaufwärts des ATG‑Startcodons.

Eigenschaften

Der isoelektrische Punkt der Bilirubinoxidase liegt bei etwa 4,1. Die Michaelis‑Konstante des Enzyms variiert geringfügig in Abhängigkeit vom Stamm. Üblicherweise ist Bilirubinoxidase bei 37 °C und in einem pH‑Bereich von 5,0 bis 9,7 stabil; die höchste Stabilität wird bei 5 °C und pH 9,2 bis 9,7 beobachtet. Die optimale Reaktionstemperatur liegt bei etwa 40 °C, der optimale Reaktions‑pH bei etwa 8; im sauren Bereich ist das Enzym nur schwer löslich. Das berichtete Molekulargewicht der Bilirubinoxidase beträgt 52 kDa bzw. 68 kDa; die Differenz kann auf das Vorhandensein natürlicher Oligosaccharidketten der Bilirubinoxidase zurückzuführen sein. Das Molekulargewicht der Bilirubinoxidase in Penicillium janthinellum beträgt 2000 kDa, was auf Metallionen zurückzuführen ist, die das Enzymprotein quervernetzen. Bilirubinoxidase verliert ihre Aktivität, wenn zweiwertige Kupferionen mittels Ascorbat und Kaliumcyanid entfernt werden. Aus Apo‑Bilirubinoxidase abgeleitete Formen gewinnen ihre Aktivität in unterschiedlichem Ausmaß zurück, wenn jeweils Kobalt‑, Cadmium‑ oder Eisenionen zugesetzt werden. Dies weist darauf hin, dass die katalytische Leistungsfähigkeit der Bilirubinoxidase eng mit Metallionen verknüpft ist. Quecksilberionen können die Enzymaktivität deutlich steigern, da Quecksilberionen und Substrat Zwischenprodukte bilden, die für die Enzymkatalyse besser geeignet sind. Kaliumcyanid, Natriumazid und Thioharnstoff können die Reaktion inhibieren. Bilirubinoxidase reagiert spezifisch mit tetrapyrrolhaltigen Verbindungen und kann zudem einige Laccase‑Substrate oxidieren.

Katalytischer Mechanismus

Bilirubinoxidase ist eine kupferhaltige Polyphenoloxidase, die drei Typen von Kupferionen enthält. Ein Typ‑I‑Kupferion vermittelt den Elektronentransfer vom Substrat zu anderen Kupferzentren. Sauerstoffmoleküle binden an ein trinukleäres Zentrum aus einem Typ‑II‑Kupferion und zwei Typ‑III‑Kupferionen und werden zu zwei Wassermolekülen reduziert. Der katalytische Prozess ist somit eine Oxidationsreaktion, bei der molekularer Sauerstoff als Elektronenakzeptor dient. Mittels Elektronenabsorptionsspektroskopie und Dünnschichtchromatographie wurde folgende spezifische Reaktion nachgewiesen: Bilirubin + 1/2 O₂ → Biliverdin + H₂O. Dabei katalysiert Bilirubinoxidase Bilirubin zur Bildung von Bilirubin; dieses wird weiter oxidiert und bildet eine farblose Substanz. Studien zeigen, dass der katalytische Mechanismus der Bilirubinoxidase eine Sekundärreaktion in Bezug auf das an das Protein gebundene Kupferion darstellt. Die Donorstruktur entspricht dem Typ CuSS*N2 (S = Cys, S* = Met, N = His) und ist damit identisch mit der Ceruloplasmin‑Familie. Bei der Reaktion der Bilirubinoxidase mit ikterischem Blut wurde die Bilirubinkonzentration mittels HPLC bestimmt; dabei zeigte sich, dass Bilirubinoxidase sowohl konjugiertes (gebundenes) als auch unkonjugiertes Bilirubin oxidieren kann. In Gegenwart von Reagenzien wie Natriumchlorid können Bilirubinoxidasen konjugiertes Bilirubin selektiv oxidieren.

Klinische Anwendung

Eine Vielzahl unterschiedlicher Lebererkrankungen kann zu Störungen des Bilirubinmetabolismus führen. Ein Anstieg des Bilirubins führt zum Auftreten eines Ikterus. Daher ist die Bilirubinbestimmung ein wichtiger Indikator der Leberfunktion. Bilirubinoxidase kann Bilirubin katalysieren und dabei Bilirubin erzeugen. Zur Bestimmung des Bilirubingehalts im Serum wird die Änderung der Absorption bei 440 nm und 450 nm gemessen. Somit kann Bilirubinoxidase für die klinische Diagnostik von Ikteruserkrankungen eingesetzt werden und wird perspektivisch auch für die Behandlung des Neugeborenenikterus und der Hyperbilirubinämie erwartet.