Messung der Enzymaktivität der Bilirubinoxidase

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Bilirubinoxidase (EC 1.3.3.5; BOX) ist ein kupferhaltiges Enzym, das die Oxidation von Bilirubin, einem Produkt des Häm-Katabolismus, zu Biliverdin katalysiert, wobei O₂ gleichzeitig zu Wasser reduziert wird. Sie ist am Porphyrin- und Chlorophyllstoffwechsel beteiligt. Dieses Enzym wurde zunächst aus dem ascomyceten Pflanzenpathogen Myrothecium verrucaria isoliert und später auch in Bacillus pumilus, der Ratte und weiteren Organismen nachgewiesen. Bilirubinoxidase ist ein monomeres Protein mit einer Molekülmasse von 60 kDa; der systematische Name dieser Enzymklasse lautet Bilirubin:Oxygen-Oxidoreduktase, auch als Bilirubinoxidase M‑1 bezeichnet. Bilirubinoxidase gehört zur Familie der Multikupferoxidasen, die ein Typ‑I‑Kupfer, ein Typ‑II‑Kupfer und zwei (ein Paar) Typ‑III‑Kupferzentren enthält. Die Typ‑II‑ und Typ‑III‑Kupfer bilden ein trinukleares Zentrum, das Sauerstoff zu Wassermolekülen reduziert, während das Typ‑I‑Kupfer als Elektronenmediator vom Substrat zum trinuklearen Zentrum fungiert.

Bilirubinoxidase ist ein Schlüsselenzym in der Diagnostik, Biotechnologie, Medizintechnik sowie in der Energieerzeugungsindustrie. Bilirubin, das Substrat der Bilirubinoxidase, besteht aus einem Tetrapyrrol, das als Produkt des physiologischen Hämabbaus entsteht und das Hauptpigment der Galle darstellt. Daher kann Bilirubinoxidase zur diagnostischen Bestimmung der Bilirubinkonzentration im Serum eingesetzt werden. Darüber hinaus ist Bilirubinoxidase von erheblichem Interesse für Niedertemperatur-Anwendungen in Biobrennstoffzellen, da sie als eines der besten Enzyme für Reaktionen an Kathoden von Biobrennstoffzellen beschrieben wurde – aufgrund ihrer hohen Reaktivität bei neutralem pH-Wert.

Abbildung: Struktur der Bilirubinoxidase aus Myrothecium verrucaria.
Referenz: Kimihiko Mizutani et al. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 2010 Jul 1; 66(Pt 7): 765-770.

Trotz der vielfältigen Funktionen der Bilirubinoxidase hat sich gezeigt, dass der Aktivitätsassay dieses Enzyms komplex und anspruchsvoll ist, vermutlich aufgrund des Verlusts von NAD⁺, NADP⁺, FAD und FMN während des Reinigungsprozesses. Bei Creative Enzymes sind wir in der Lage, das Holoenzym in ausreichender Reinheit und Menge herzustellen und spektrophotometrische Assays zur Bestimmung der Bilirubinoxidase-Aktivität durchzuführen, indem die Absorption bei 440 nm verfolgt wird. Creative Enzymes unterstützt mit herausragender Technologie, fundiertem Fachwissen und modernster Instrumentierung die Forschung unserer Kunden in exzellenter Weise. Insgesamt wird Creative Enzymes stets Ihr zuverlässiger Partner sein.