CHOD

Cholesterinoxidase (3β-Hydroxysteroloxidase, ChOx, EC1.1.3.6) wurde erstmals 1943 entdeckt und gehört zur Gruppe der Flavoprotein-Oxidoreduktasen. Cholesterinoxidase katalysiert hauptsächlich die Dehydrierung des C-3 von Cholesterin. Darüber hinaus ist es ein Isomerisierungsenzym, das die Isomerisierung von Cholesterin-5-en-3-on zu Cholest-4-en-3-on nach der Dehydrierung von Cholesterin katalysiert. Somit ist Cholesterinoxidase ein bifunktionales Enzym, das Cholesterin katalysiert, um die Endprodukte Cholest-4-en-3-on und Wasserstoffperoxid zu erzeugen.

Klassifikation

Die flavinische prosthetische Gruppe der Cholesterinoxidase umfasst FAD (Flavin-Adenin-Dinukleotid) und FMN (Riboflavin-Monophosphat), und die prosthetische Gruppe der meisten Enzyme ist FAD, und nur die prosthetische Gruppe eines Enzyms wurde bisher als FMN gefunden. Cholesterinoxidase kann in zwei Hauptkategorien unterteilt werden. In der Klasse I Cholesterinoxidase sind FAD und das Enzym nicht kovalent gebunden. Diese Enzymklasse gehört zu den Glukose-Methanol-Cholin-Oxidoreduktasen, einschließlich Cholesterinoxidasen, die von Streptomyces sp, B. sterolicum, Rhodococcus equi und Mycobacterium spp. abgeleitet sind. Aufgrund der engen nicht-kovalenten Bindungseigenschaften solcher Enzyme und FAD können kleine Molekül-Liganden entworfen werden, um das Enzym in einem Schritt zu reinigen. Das Reinigungsverfahren der nukleophilen Chromatographie kann schließlich eine Proteinreinheit von 95 % erreichen. In der Klasse II Cholesterinoxidase ist FAD kovalent an das Enzym gebunden. FAD ist über die Methylgruppe des Isoxazinsrings kovalent an das ND-Atom oder NE-Atom des Imidazolrings am Histidinrest des Enzymproteins gebunden. Vertreter der Klasse II Cholesterinoxidasen stammen von R. erythropolis, Burkholderia spp. und Chromobacterium sp., die auch als Vanillylalkoholoxidase (VAO) bekannt sind. Einige Stämme, wie B. sterolicum, können gleichzeitig zwei Klassen von Cholesterinoxidasen produzieren.

Quellen

Cholesterinoxidase stammt allgemein aus Bakterien und Actinobakterien, die sowohl von gramnegativen als auch von grampositiven Bakterien produziert werden. Neben den oben genannten enzymproduzierenden Mikroorganismen wurden in den letzten Jahren viele neue Stämme entdeckt, die Cholesterinoxidase produzieren, darunter B. subtilis, Enterococcus hirae, Pseudomonas aeruginosa, Chryseobacterium gleum. Darüber hinaus wurde das Vorhandensein von Cholesterinoxidase auch in philophilen Mikroorganismen festgestellt. Natürlich haben diese Cholesterinoxidasen auch eine Präferenz für Eigenschaften. Zum Beispiel liegt der optimale pH-Wert eines Enzyms, das von einem alkaliphilen Mikroorganismus stammt, bei 10, und der optimale pH-Wert einer neutralen Cholesterinoxidase liegt im Allgemeinen bei etwa 7.

Struktur

Cholesterinoxidase besteht allgemein aus zwei Domänen, einer prosthetischen Bindungsdomäne und einer Substratbindungsdomäne. In der Klasse I Cholesterinoxidase ist die charakteristische Sequenz von GXGXGGA18XE in der prosthetischen Bindungsdomäne allgemein vorhanden; die entsprechende charakteristische Sequenz in der Klasse II Cholesterinoxidase ist GXGXXG19XD/E. Die Struktur des katalytischen Zentrums der beiden Enzymklassen ist ziemlich unterschiedlich. Für die Klasse I Cholesterinoxidase besteht das katalytische Zentrum allgemein aus His, Glu, Asn; und der entsprechende Rest in der Klasse II Cholesterinoxidase ist Arg, Glu, Asn.

Katalytischer Mechanismus

Der katalytische Prozess der Cholesterinoxidase wird hauptsächlich in die folgenden zwei Schritte unterteilt:

(1) Dehydrierung: Die Hydroxylgruppe am C-3 des Cholesterinkohlenstoffs wird katalytisch von der Cholesterinoxidase oxidiert, um Cholest-5-en-3-on zu bilden. In diesem Prozess werden die beiden oxidierten Flavinmoleküle durch zwei Elektronen, die durch die katalytische Reaktion übertragen werden, reduziert. Das reduzierte Flavinmolekül reagiert mit Sauerstoff, um Wasserstoffperoxid zu bilden und kehrt in den oxidierten Zustand zurück. Die Reaktion in dieser Phase folgt einem heterogenen Spaltungsmechanismus (Hydridübertragung).

(2) Isomerisierung: Das oxidierte Zwischenprodukt Cholest-5-en-3-on wird unter der Katalyse von Cholesterinoxidase isomerisiert, um Cholest-5-en-3-on zu bilden.

Abbildung 1. Mechanismus der Reaktion, die von Cholesterinoxidase katalysiert wird. (Kumari L. 2012)

Die Dehydrierungsreaktion ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt dieses katalytischen Prozesses.

Anwendungen

• Bestimmung der Cholesterinwerte im Serum

Die derzeitige Methode zur Bestimmung des menschlichen Serumcholesterins ist eine enzymatische Kopplungsmethode. In den letzten Jahren wurde die Anwendung dieser Methode im Bereich der medizinischen Diagnostik durch den Aufstieg der Bionik und Materialwissenschaften weiter verstärkt. Zum Beispiel kann Cholesterinoxidase zu einem Cholesterin-Biosensor gemacht werden, indem sie auf der Oberfläche des Materials fixiert wird. Die Anwendung des Biosensors kann die Nutzungseffizienz des Enzyms effektiv verbessern und die Kosten der Nachweismethode erheblich senken.

• Schädlingsbekämpfung

Cholesterinoxidase kann die Larven des Baumwollkapselkäfers effektiv abtöten, und die biologische Aktivität ist vergleichbar mit der insektiziden Proteinaktivität von Bacillus thuringiensis. Cholesterinoxidase kann auch zur Bekämpfung einiger Lepidopterenlarven eingesetzt werden. Der insektizide Mechanismus zeigt, dass Cholesterinoxidase den Tod der Raupe verursacht, indem sie die Epithelzellen des larvalen Mitteldarms lysiert.

• Antibiotikumziel

Rhodococcus equi ist ein pathogener Mikroorganismus, der junge Pferde infizieren kann. Darüber hinaus ist es auch ein bedingter Krankheitserreger für den Menschen. Dieser Mikroorganismus dringt in die Wirtszelle ein, indem er die Zellmembranstruktur hauptsächlich durch Cholesterinoxidase zerstört, wodurch er in die Wirtszelle eindringt und für Patienten mit Immunschwäche äußerst schädlich ist. Cholesterinoxidase spielt auch eine wichtige Rolle bei der Infektion von Menschen durch Mycobacterium tuberculosis, einen weiteren Krankheitserreger, der eine ernsthafte Bedrohung für den Menschen darstellt. In diesem Prozess schwächt die Cholesterinoxidase des Krankheitserregers zunächst das Abwehrsystem der Wirtszelle, indem sie an Antikörper auf der Oberfläche von Makrophagen bindet. Daher kann Cholesterinoxidase als Ziel für das Screening neuer Antibiotika verwendet werden. Der Vorteil der Wahl dieses Ziels besteht darin, dass Cholesterinoxidase in Säugetierzellen nicht vorhanden ist, sodass die Wahrscheinlichkeit einer versehentlichen Schädigung von tierischen Zellen durch die ausgewählten Antibiotika sehr gering ist.

Referenz