DFPase

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Einleitung

Die Diisopropylfluorophosphatase (DFPase; EC 3.1.8.2) aus dem Tintenfisch Loligo vulgaris ist ein 35‑kDa‑Protein, das aus 314 Aminosäuren besteht. Es handelt sich um eine wirksame Ca²⁺-abhängige Phosphotriesterase, die eine Reihe organophosphorhaltiger Verbindungen hydrolysieren kann, die als irreversible Acetylcholinesterase(AChE)-Inhibitoren wirken. Zu ihren Substraten zählen Diisopropylfluorophosphat (DFP) sowie eine Reihe hochtoxischer Organophosphor(OP)-Nervenkampfstoffe vom G‑Typ, wie Sarin (GB), Tabun (GA) usw.

Abbildung 1. Strukturen der DFPase-Substrate DFP, GB, GF, GD und GA. Stereozentren sind durch Sternchen gekennzeichnet (Chen, J.C.; et al. 2010)

Die von DFPase katalysierte Hydrolysereaktion bildet Phosphat- bzw. Phosphonat- und Fluoridionen und entgiftet dadurch organophosphorhaltige Wirkstoffe. Da das Enzym in großen Mengen exprimiert werden kann und eine hohe Toleranz gegenüber organischen Lösungsmitteln sowie eine ausgeprägte Stabilität aufweist, gilt DFPase als vielversprechender Kandidat für die enzymatische Dekontamination. Das in der erstmals bestimmten DFPase-Struktur nahe dem aktiven Zentrum beobachtete His287 wurde als allgemeine Base der Reaktion vermutet. Nachfolgende Mutationsversuche an His287 zeigten jedoch, dass sich die Gesamtaktivität des Enzyms selbst bei Austausch gegen aliphatische Reste (z. B. Leucin) kaum verändert. In einer Reihe weiterer Arbeiten wurden Funktion und Struktur des DFPase-Mechanismus untersucht, einschließlich Mutanten aktiver-Zentrum-Reste, Isotopenmarkierung und der 2,2‑Å‑Neutronenstruktur von DFPase. Daraus wurde ein Reaktionsmechanismus abgeleitet, der einen direkten nukleophilen Angriff von Asp229 sowie ein Phosphoenzym‑Intermediat umfasst.

Abbildung 2. Potenzielle Reaktionsmechanismen für DFPase (Chen, J.C.; et al. 2010)

Struktur und Umgebung des aktiven Zentrums

Es wurden zahlreiche DFPase-Strukturen beschrieben. Neben Holoenzymen wurden mehrere Strukturen von Mutanten des aktiven Zentrums sowie die Struktur eines Komplexes mit dem designten Substratanalogon DcPPA aufgeklärt. Aus der Gesamtstruktur ist ersichtlich, dass das Protein eine sechsschaufelige β‑Propeller-Faltung ausbildet, die den zentralen Wassertunnel umgibt, und zwei Calciumionen koordiniert. Das hochaffine Calcium Ca1 im zentralen Wassertunnel ist für die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität erforderlich und zeigt eine seltene Ca‑N‑Koordination über die Seitenkette von His274. Das niedrigaffine Calciumion Ca2 befindet sich am Boden der Bindungstasche des aktiven Zentrums und ist für die katalytische Aktivität des Enzyms essenziell. Die Calciumionen werden unterhalb des aktiven Zentrums zusätzlich durch zwei Wassermoleküle koordiniert, die mit dem zentralen Wassertunnel verbunden sind, sowie durch ein Lösungsmittelmolekül (W33) in der Bindungstasche des aktiven Zentrums.

Die Koordinationsreste des katalytischen Calciums wurden umfassend mutiert, und Veränderungen dieser Koordinationsreste haben einen wesentlichen Einfluss auf Bindung und Aktivität. Von den 10 erzeugten Mutanten zeigten nur N175D und N120D eine äußerst geringe enzymatische Aktivität gegenüber DFP, während die übrigen 8 Mutanten inaktiv waren. Wenn im aktiven Zentrum nur noch eine negative Ladung verbleibt, lässt sich die Inaktivität dieser Mutanten auf den Verlust des katalytischen Calciums zurückführen. Glu21 scheint eine entscheidende Rolle bei der Calciumkoordination zu spielen, da eine Mutation von Glu21 – unabhängig davon, wie viele negative Ladungen sich in der Umgebung befinden – zum Verlust der Calciumbindungsfunktion führt.

Abbildung 3. Faltung von DFPase und Umgebung des katalytischen Calciums (Chen, J.C.; et al. 2010)

Re-Engineering der DFPase

Neutronenstrukturdaten der DFPase und Studien zur Isotopenmarkierung stützen einen nukleophilen Angriff von Asp229 auf das P‑Atom des Substrats, was zur Bildung von Phosphoenzym‑Intermediaten und zur anschließenden Hydrolyse führt. Diese Informationen können für ein rationales Design zur Verbesserung der Gesamtaktivität und der Entgiftungseigenschaften des Enzyms von großer Bedeutung sein. Darüber hinaus unterstreicht die DFPase-Struktur die Rigidität der Umgebung des aktiven Zentrums; die Kokristallstruktur mit dem Substratanalogon DcPPA zeigt nach Bindung nur geringe konformationelle Veränderungen im aktiven Zentrum, wodurch DFPase ein Beispiel für ein „Lock‑and‑Key“-Enzym darstellt. DFPase vom Wildtyp bindet und hydrolysiert bevorzugt die weniger toxischen Stereoisomere von G‑Typ‑Nervenkampfstoffen. Für dieses Re-Engineering wurden Modelle von Phosphatase‑Intermediaten für die R_P- und S_P-Stereoisomere von Cyclosarin generiert. Das aktive Zentrum wurde so modifiziert, dass das toxischere R_P-Stereoisomer aufgenommen werden kann. Durch Einführung kürzerer Seitenketten an den Resten 37, 144 und 146 wird auf einer Seite des aktiven Zentrums eine offenere Bindungstasche geschaffen; auf der gegenüberliegenden Seite wird diese durch Einführung einer größeren Seitenkette an Rest 195 eingeschränkt. Die beiden erhaltenen Mutanten waren E37A/Y144A/R146A/T195M und E37D/Y144A/R146A/T195M. Die Aktivität dieser beiden Mutanten wurde geprüft und ihre Röntgenstrukturen wurden ebenfalls analysiert. Beide zeigten eine insgesamt erhöhte Aktivität gegenüber racemischen Gemischen von Cyclosarin (GF) und Sarin (GB). Im Vergleich zur Wildtyp‑DFPase ist die Stereoselektivität der Mutante E37A/Y144A/R146A/T195M für das S_P-Stereoisomer von Cyclosarin (GF) nahezu 200‑fach höher. Die Mutanten weisen eine höhere spezifische Aktivität gegenüber DFP, GF und GB auf, und durch die rasche Hydrolyse der S_P-Stereoisomere werden die Entgiftungseigenschaften signifikant verbessert.