DFPase

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Einführung

Diisopropylfluorophosphatase (DFPase; EC 3.1.8.2) aus dem Tintenfisch Loligo vulgaris ist ein 35 kDa Protein, das aus 314 Aminosäuren besteht. Es ist eine effektive Ca²⁺-abhängige Phosphotriesterase, die eine Reihe von organophosphorhaltigen Verbindungen hydrolysieren kann, die als irreversible Acetylcholinesterase (AChE) Inhibitoren wirken. Zu seinen Substraten gehören Diisopropylfluorophosphat (DFP) und eine Reihe von hochgiftigen G-Typ organophosphorhaltigen (OP) Nervengiften, wie Sarin (GB), Tabun (GA) und so weiter.

Abbildung 1. Strukturen der DFPase-Substrate DFP, GB, GF, GD und GA. Stereozentren sind durch Sterne gekennzeichnet (Chen, J.C.; et al. 2010)

Die von DFPase katalysierte Hydrolysereaktion bildet Phosphat- oder Phosphonat- und Fluoridionen und entgiftet somit organophosphorhaltige Agenzien. Da das Enzym in großen Mengen exprimiert werden kann und eine hohe Toleranz gegenüber organischen Lösungsmitteln sowie eine starke Stabilität zeigt, wird DFPase als vielversprechender Kandidat für die enzymatische Dekontamination angesehen. Das His287 in der Nähe der aktiven Stelle, das in der erstmals erhaltenen DFPase-Struktur beobachtet wurde, wird als die allgemeine Base in der Reaktion vermutet. Allerdings zeigten nachfolgende Mutationsversuche an His287, dass selbst wenn es durch aliphatische Reste (wie Leucin) ersetzt wird, die Gesamtaktivität des Enzyms kaum verändert wird. Eine Reihe nachfolgender Forschungen untersuchte die Funktion und Struktur des DFPase-Mechanismus, einschließlich Mutanten von aktiven Stellen-Resten, Isotopenmarkierung und der 2,2 Å Neutronenstruktur von DFPase. Dies schlug einen Reaktionsmechanismus vor, der einen direkten nukleophilen Angriff von Asp229 und ein Phosphoenzymintermediat umfasst.

Abbildung 2. Potenzielle Reaktionsmechanismen für DFPase (Chen, J.C.; et al. 2010)

Struktur und Umgebung der aktiven Stelle

Viele DFPase-Strukturen wurden berichtet. Neben Holoenzymen wurden auch mehrere Strukturen von aktiven Stellen-Mutanten und die Struktur des Komplexes mit dem entworfenen Substratanalogon DcPPA gelöst. Aus der Gesamtstruktur ist zu erkennen, dass das Protein einen sechsblättrigen β-Propeller annimmt, der den zentralen Wassertunnel umgibt und zwei Calciumionen koordiniert. Das hochaffine Calcium Ca1, das sich im zentralen Wassertunnel befindet, ist notwendig, um die strukturelle Integrität aufrechtzuerhalten und zeigt eine seltene Ca-N-Koordination durch die Seitenkette von His274. Das niedrigaffine Calciumion Ca2 befindet sich am Boden der aktiven Stelle, was für die katalytische Aktivität des Enzyms unerlässlich ist. Calciumionen werden weiter unterhalb der aktiven Stelle von zwei Wassermolekülen koordiniert, die mit dem zentralen Wassertunnel verbunden sind, und einem Lösungsmittelmolekül (W33) in der aktiven Stelle.

Die katalytischen Calcium-Koordinationsreste haben umfangreiche Mutationen durchlaufen, und die Veränderungen in diesen Calcium-Koordinationsresten haben einen wichtigen Einfluss auf die Bindung und Aktivität. Unter den 10 erzeugten Mutanten zeigten nur N175D und N120D eine extrem schwache enzymatische Aktivität gegen DFP, während die verbleibenden 8 Mutanten inaktiv waren. Wenn nur eine negative Ladung in der aktiven Stelle verbleibt, kann die Inaktivität dieser Mutanten auf den Verlust von katalytischem Calcium zurückgeführt werden. Glu21 scheint eine entscheidende Rolle bei der Calciumkoordination zu spielen, denn sobald Glu21 mutiert wird, führt es unabhängig von der Menge an negativer Ladung in der Nähe zum Verlust der Calciumbindungsfunktion.

Abbildung 3. Faltung von DFPase und Umgebung des katalytischen Calciums (Chen, J.C.; et al. 2010)

Neugestaltung von DFPase

Die Neutronenstruktur von DFPase und Isotopenmarkierungsstudien unterstützen den nukleophilen Angriff von Asp229 auf das P-Atom des Substrats, was zur Bildung von Phosphoenzymintermediaten und anschließender Hydrolyse führt. Diese Informationen können eine wichtige Rolle im rationalen Design spielen, um die Gesamtaktivität und Entgiftungseigenschaften des Enzyms zu verbessern. Darüber hinaus hebt die Struktur von DFPase die Starrheit der Umgebung der aktiven Stelle hervor, und die Ko-Kristallstruktur mit dem Substratanalogon DcPPA zeigt nach der Bindung nur geringe konformationale Veränderungen in der aktiven Stelle, was DFPase zu einem Beispiel für ein Schloss-und-Schlüssel-Enzym macht. Das Wildtyp-DFPase bindet bevorzugt und hydrolysiert die weniger toxischen Stereoisomere von G-Typ Nervengiften. Für diese Neugestaltung wurden Modelle eines Phosphatase-Intermediats für die R_P und S_P Stereoisomere von Cyclosarin erzeugt. Die aktive Stelle wurde modifiziert, um das toxischere R_P Stereoisomer aufzunehmen. Durch die Einführung kürzerer Seitenketten an den Resten 37, 144 und 146 wird auf einer Seite der aktiven Stelle eine offenere Bindungstasche geschaffen, während die gegenüberliegende Seite durch die Einführung einer größeren Seitenkette am Rest 195 eingeschränkt wird. Die beiden erhaltenen Mutanten waren E37A/Y144A/R146A/T195M und E37D/Y144A/R146A/T195M. Die Aktivität dieser beiden Mutanten wurde getestet und ihre Röntgenstrukturen wurden ebenfalls analysiert. Beide zeigten eine insgesamt verbesserte Aktivität gegen racemische Mischungen von Cyclosarin (GF) und Sarin (GB). Im Vergleich zum Wildtyp-DFPase ist die Stereoselektivität des Mutanten E37A/Y144A/R146A/T195M gegenüber dem S_P Stereoisomer von Cyclosarin (GF) fast 200 Mal höher. Die Mutanten haben eine höhere spezifische Aktivität gegenüber DFP, GF und GB, und mit der schnellen Hydrolyse der SP-Stereoisomere sind die Entgiftungseigenschaften erheblich verbessert.