Endo-β-N-acetylglucosaminidase

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Endoglykosidase ist ein Enzym, das intakte Glykanstrukturen von Glykoproteinen abspaltet. Diese Enzyme sind in Reinigungsformulierungen, die kein Glycerol, NaCl oder andere Zusatzstoffe (z. B. EDTA) enthalten, hochstabil. Alle Enzyme sind darauf zu prüfen, dass keine proteolytische oder unerwartete Glykosidase-Aktivität vorliegt. Endoglykosidase ist das am häufigsten eingesetzte Enzym in der Glykoproteinanalyse. Diese Enzyme setzen vollständige Glykane aus Glykoproteinen frei, während Exoglykosidasen einzelne Monosaccharide (d. h. Sialinsäure, Galaktose, β-N-Acetylglucosamin, Mannose usw.) abspalten.

Abbildung 1. Struktur der Endoglykosidase.

Einführung

Obwohl PNGase F tatsächlich eine Amidase ist, wird sie aufgrund ihrer vergleichbaren Aktivität zur Abspaltung intakter N-verknüpfter Glykane üblicherweise den Enzymen zugerechnet. Sie spaltet zwischen der Aminosäure Asparagin und dem ersten β-N-Acetylglucosamin-Zucker (GlcNAc) des Chitobiose-Kerns des N-verknüpften Glykans. Die Enzyme Endo F und Endo H spalten N-verknüpfte Glykane zwischen dem ersten GlcNAc und dem zweiten GlcNAc und hinterlassen dabei geladene Reste, was die Löslichkeit des deglykosylierten Proteins erhöht und dadurch das Risiko einer Aggregatbildung bzw. -präzipitation reduziert. PNGase F spaltet alle N-verknüpften Glykane, während Endo H und Endo F spezifische Typen N-verknüpfter Glykane entfernen. Endoglykosidasen spalten ganze Glykan-Gruppen von Glykoproteinen ab. Die am häufigsten verwendete Endoglykosidase, Peptid-N-Glykosidase F, ist tatsächlich eine Amidase, die die Deglykosylierung der meisten N-verknüpften Glykoproteine katalysiert. Das Enzym katalysiert die Spaltung zwischen dem innersten N-Acetylglucosamin (GlcNAc) des Chitobiose-Kerns und der Aminogruppe des Asparaginrests.

Klassifizierung

Es gibt eine Vielzahl von Endoglykosidasen, die auf N-verknüpfte Glykane wirken. Sie besitzen alle identische Spaltstellen zwischen den beiden GlcNAc-Resten des Chitobiose-Kerns, erkennen und spalten jedoch unterschiedliche Typen N-verknüpfter Glykane. Endoglykosidase H spaltet innerhalb des Chitobiose-Kerns hochmannosereicher und einiger hybrider Oligosaccharide aus N-verknüpften Glykoproteinen. Endoglykosidase S ist hochspezifisch für die Entfernung N-verknüpfter Glykane aus der schweren Kette von nativem IgG. Endoglykosidase D spaltet hingegen paucimannose N-verknüpfte Glykane. Es gibt weniger Endoglykosidasen, die auch als α-N-Acetylgalactosaminidasen bezeichnet werden und auf O-verknüpfte Glykane aktiv sind. Die Mehrzahl der bislang identifizierten O-Glykosidasen ist nur gegenüber dem Disaccharid Galβ1,3GalNAcα-O-Ser/Thr aktiv und erfordert vor der Katalyse die Entfernung von Sialinsäure und sämtlichen weiteren angehängten Zuckerresten, bevor das Enzym dieses Core-1-Disaccharid vom Glykoprotein abspalten kann. Es existiert jedoch ein Enzym mit etwas breiterer O-Glykosidase-Spezifität, das die Abspaltung von Core-1- (Galβ1,3GalNAc) oder Core-3- (GlcNAcβ1,3GalNAc) O-verknüpften Disacchariden aus Glykoproteinen katalysieren kann.

Mechanismus

Der Mechanismus beruht auf enzymatischer Hydrolyse. Es gibt zwei Formen des Endoglykosidase-Mechanismus: Die säurekatalysierte Protonierung des glykosidischen Sauerstoffs kann die Stereochemie am anomeren Kohlenstoff erhalten, oder die säurekatalysierte Protonierung des glykosidischen Sauerstoffs wird von einem Angriff von Wassermolekülen begleitet, die durch basische Aminosäurereste aktiviert werden, wodurch eine stereochemische Umwandlung entsteht. Beide Mechanismen weisen denselben Abstand zwischen Protonendonator und glykosidischem Sauerstoff auf, sodass der Protonendonator für eine Wasserstoffbrückenbindung nahe genug am glykosidischen Sauerstoff liegt. Da der Retentionsmechanismus in der Nähe der beiden Carboxylgruppen abläuft, erfolgt er über einen Doppelverdrängungsmechanismus, der zu einem kovalenten Glykosylase-Zwischenprodukt führt. Exoglykosidasen entfernen jedes Kohlenhydratmonomer (x) nacheinander, beginnend bei xn und von einem Ende aus, während Endoglykosidasen an jeder glykosidischen Bindung (-) schneiden können und die verknüpften Oligosaccharide, die bestimmte Kohlenhydrate mit bestimmten Proteinen verbinden, abspalten.

Anwendung

Der Einsatz von Endoglykosidasen für die Mutagenese besitzt großes Potenzial. Wenn dieses neue mutierte Enzym mit der geeigneten Verbindung in Kontakt kommt, kann die Oligosaccharidsynthese ablaufen, und die neu gebildete Polymerkettenstruktur wird nicht hydrolysiert. Dies ist ein sehr nützliches Werkzeug, da Oligosaccharide ein erhebliches therapeutisches Potenzial besitzen. Beispielsweise weist der hexavalente Zucker H-Zucker auf eine maligne Zelltransformation hin, die mit Brust-, Prostata- und Ovarialkarzinom assoziiert ist. Endoglykosidase könnte auch eine Rolle bei der Bekämpfung von Autoimmunerkrankungen wie Arthritis und systemischem Lupus erythematodes spielen. Im Jahr 2008 zeigte eine Forschergruppe, dass die Injektion von Endoglykosidase S „IgG-assoziierte Zuckerdomänen im Körper effektiv entfernen und den durch Autoantikörper vermittelten proinflammatorischen Prozess in einer Vielzahl von Autoimmunmodellen stören kann“. Offensichtlich eröffnen diese Enzymmodifikation und -mutagenese breite Perspektiven, um zahlreichen Erkrankungen im Körper entgegenzuwirken.

Referenz

1. Davies, G.; et al. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure. 1995, 3 (9): 853–59.