Endo-β-N-acetylglucosaminidase

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Endoglycosidase ist ein Enzym, das intakte Glykane von Glykoproteinen spaltet. Diese Enzyme sind in Reinigungsformulierungen, die kein Glycerin, NaCl oder andere Zusatzstoffe (wie EDTA) enthalten, hoch stabil. Testen Sie alle Enzyme auf proteolytische oder unerwartete Glykosidaktivität. Endoglycosidase ist das am häufigsten verwendete Enzym in der Glykoproteinanalyse. Diese Enzyme setzen vollständige Glykane von Glykoproteinen frei, während Exoglycosidase einzelne Monosaccharide (d.h. Sialinsäure, Galactose, β-N-Acetylglucosamin, Mannose usw.) freisetzt.

Abbildung 1. Struktur der Endoglycosidase.

Einführungen

Obwohl PNGase F tatsächlich eine Amidase ist, wird sie aufgrund ihrer ähnlichen Aktivität, intakte N-verknüpfte Glykane zu spalten, normalerweise zu den Enzymen gezählt. Es spaltet zwischen der Asparagin-Aminosäure und dem ersten β-N-Acetylglucosamin-Zucker (GlcNAc) des Chitobiose-Kerns des N-verknüpften Glykans. Das Enzym Endo F und Endo H spalten N-verknüpfte Glykane zwischen dem ersten GlcNAc und dem zweiten GlcNAc, wobei geladene Reste zurückbleiben, was die Löslichkeit des deglykosilierten Proteins erhöht und somit die Möglichkeit der Aggregatniederschlagung des Proteins verringert. PNGase F spaltet alle N-verknüpften Glykane, während die Enzyme Endo H und Endo F spezifische Typen von N-verknüpften Glykane entfernen. Endoglycosidasen spalten gesamte Glykangruppen von Glykoproteinen. Die am häufigsten verwendete Endoglycosidase, Peptide-N-Glycosidase F, ist tatsächlich eine Amidase, die die Deglykosylierung der meisten N-verknüpften Glykoproteine katalysiert. Das Enzym katalysiert die Spaltung zwischen dem innersten N-Acetylglucosamin (GlcNAc) des Chitobiose-Kerns und der Aminogruppe des Asparagin-Restes.

Klassifikationen

Es gibt eine Vielzahl von Endoglycosidasen, die auf N-verknüpfte Glykane aktiv sind. Sie haben alle identische Spaltstellen zwischen den beiden GlcNAc-Resten des Chitobiose-Kerns, erkennen und spalten jedoch unterschiedliche Typen von N-verknüpften Glykane. Endoglycosidase H spaltet innerhalb des Chitobiose-Kerns von hochmannosierten und einigen hybriden Oligosacchariden von N-verknüpften Glykoproteinen. Endoglycosidase S ist hochspezifisch für die Entfernung von N-verknüpften Glykane von der schweren Kette von nativem IgG. Während Endoglycosidase D paucimannose N-verknüpfte Glykane spaltet. Es gibt weniger Endoglycosidasen, die auch als α-N-Acetylgalactosaminidasen bezeichnet werden und auf O-verknüpfte Glykane aktiv sind. Die Mehrheit der bisher gefundenen O-Glycosidasen ist nur auf einem Disaccharid Galβ1,3GalNAcα-O-Ser/Thr aktiv, was die Entfernung von Sialinsäure und anderen angehängten Zuckerrückständen erfordert, bevor das Enzym die Entfernung dieses Core 1 Disaccharids von dem Glykoprotein katalysieren kann. Es gibt jedoch ein Enzym mit einer etwas breiteren O-Glycosidase-Spezifität, das in der Lage ist, Core 1 (Galβ1,3GalNAc) oder Core 3 (GlcNAcβ1,3GalNAc) O-verknüpfte Disaccharide von Glykoproteinen zu katalysieren.

Mechanismus

Der Mechanismus ist enzymatische Hydrolyse. Es gibt zwei Formen des Endoglycosidase-Mechanismus; die säurekatalysierte Protonierung des Glykosid-Oxigens kann die Stereochemie am anomeren Kohlenstoff beibehalten, oder die säurekatalysierte Protonierung des Glykosid-Oxigens wird von dem Angriff von Wassermolekülen begleitet, die durch Basenreste aktiviert werden, um die Stereochemie zu erzeugen. Umwandlung. Die beiden Mechanismen haben den gleichen Abstand zwischen dem Protonenspender und dem Glykosid-Oxigen, sodass der Protonenspender nahe genug am Glykosid-Oxigen für Wasserstoffbrückenbindungen ist. Da der Retentionsmechanismus nahe an den beiden Carboxylgruppen liegt, durchläuft er einen Doppelverdrängungsmechanismus, was zu einem kovalenten Glykosylase-Intermediate führt. Exoglycosidase entfernt jedes Kohlenhydratmonomer (x) nacheinander, beginnend von xn und einem Ende, während Endoglycosidase an jeder glykosidischen Bindung (-) schneiden kann und bestimmte Kohlenhydrate mit bestimmten Proteinen kombiniert. Die verknüpfte Eigenschaft "verknüpfte Oligosaccharide" wird gespalten.

Anwendung

Die Verwendung von Endoglycosidase für die Mutagenese hat großes Potenzial. Wenn dieses neue mutierte Enzym mit der entsprechenden Verbindung in Kontakt kommt, wird die Oligosaccharidsynthese fortschreiten und die neu gebildete Polymerkette wird nicht hydrolysiert. Dies ist ein sehr nützliches Werkzeug, da Oligosaccharide großes therapeutisches Potenzial haben. Zum Beispiel wird der hexavalente Zucker H auf die maligne Zelltransformation hinweisen, die mit Brust-, Prostata- und Eierstockkrebs verbunden ist. Endoglycosidase kann auch eine Rolle im Kampf gegen Autoimmunerkrankungen wie Arthritis und systemischen Lupus erythematodes spielen. Im Jahr 2008 zeigte eine Gruppe von Forschern, dass die Injektion von Endoglycosidase S "wirksam IgG-verwandte Zuckerdomänen im Körper entfernen und den proinflammatorischen Prozess, der durch Autoantikörper in einer Vielzahl von Autoimmunmodellen vermittelt wird, stören kann. Offensichtlich haben diese Enzymmanipulation und Mutation breite Perspektiven, um viele Krankheiten im Körper zu bekämpfen.

Referenz

1. Davies, G.; et al. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure. 1995, 3 (9): 853–59.