endo-1,4-β-Galactanase

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Einführung

Die Verarbeitung von Pflanzenbiomasse ist ein sehr wichtiges und zunehmend geschätztes industrielles Feld. Derzeit hat der enzymatische Abbau von Pflanzenzellwänden erhebliches Interesse geweckt. Die Hauptkomponente der Pflanzenzellwände ist Pektin, das aus glatten Regionen von Homogalakturonan und haarigen Regionen von Rhamnogalakturonan besteht. Rhamnogalakturonan-I ist die am häufigsten vorkommende Komponente in der haarigen Region und es ist ein Polysaccharid, das aus abwechselnden Einheiten von α-1,2-verknüpftem L-Rhamnose und α-1,4-verknüpftem D-Galakturonsäure aufgebaut ist. Die C4-Position von Rhamnose kann als Anheftungsstelle für die Verzweigungen von Polysacchariden wie Arabinans, Galaktans und Arabinogalaktan verwendet werden, was Rhamnogalakturonan stark verzweigt und eine "haarige Region" bildet.

Derzeit wurden die strukturellen Informationen von Rhamnogalakturonase A und Rhamnogalakturonan-Acetylesterase erhalten, und sie wirken auf das Rückgrat von Rhamnogalakturonan I, ebenso wie drei β-1,4-Galaktanasen (GAL), die auf die β-1,4-Verknüpfungen in Galaktan- und Arabinogalaktanverzweigungen wirken. GAL gehört zur Familie 53 der Glycosid-Hydrolasen, die ein Mitglied des Clans GH-A ist. Wissenschaftler haben die Pilz-GAL-Struktur von Aspergillus aculeatus bestimmt, die die erste verfügbare Struktur von β-1,4-Galaktanase und Enzymen der Familie 53 darstellt.

Gesamtstruktur von BLGAL

Bacillus licheniformis-Galaktanase (BLGAL) kristallisiert in der Raumgruppe P2₁, und die beiden nicht-kristallographisch symmetrieverwandten Moleküle sind nahezu identisch. Die Struktur des nativen Proteins und der Komplexe ist sehr ähnlich, und die Gesamtfaltung ist eine regelmäßige (βα) ₈-Fasskonformation. Die Schleifen, die auf den β-Strängen 1 und 3 folgen, sowie die lange Schleife von etwa 65 Resten, die auf den β-Strang 8 folgt, enthalten zusätzliche Elemente der Sekundärstruktur. Es gibt ein Calciumion an der Spitze des Fasses, entfernt von dem katalytischen Rest (>16 Å). Es ist koordiniert mit den Resten der beiden langen Schleifen, die auf den β-Strang 7 (Asp272, Asp274, His276 und Asn278) und 8 (Ser367 und Asp370) folgen.

Abbildung 1. Stereo-Illustration der Gesamtstruktur von BLGAL

Die aktive Stelle und die Substratbindungsrinne

In BLGAL ist die katalytische Säure/Base Glu165 am Ende des β-Strangs 4, Glu263 am Ende des β-Strangs 7 wird als katalytisches Nucleophil verwendet. Die Bindungsstellen für Galaktobiose und Galaktotriose, die im Komplex identifiziert wurden, umfassen zwei Substellen (22 und 23) und drei Substellen (22, 23 und 24). Die Reste Trp115, Trp3347 und Trp36 sind an der Substratbindung beteiligt und dienen als Plattformen für die drei Pyranoseeinheiten an den Substellen 22, 23 und 24, wie in Abbildung 2 (a) und (b) gezeigt. Die detaillierten Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Galaktooligosacchariden sind in Abbildung 2 (c) und (d) dargestellt.

Abbildung 2. Nahansichten der Substratbindungs-Substellen 24, 23 und 22 in den endgültigen Modellen für die Galaktobiose- und Galaktotriosekomplexe

Diskussion

Im Vergleich zu GAL aus Bacillus-Arten kann das Pilz-GAL Galaktan vollständiger abbauen. Die nicht-produktive Bindung kleiner Oligosaccharide an BLGAL könnte erklären, warum dieses Enzym β-1,4-Galaktan nicht so effizient wie AAGAL abbauen kann. Die drei Tryptophanreste bilden die aromatische Plattform der Substellen -4, -3 und -2. Diese drei Tryptophanreste sind im Wesentlichen parallel zum Zuckerring und stapeln sich gegen ihre α-Seite. Diese umfangreiche parallele Wechselwirkung ist zwischen β-1,4-verknüpften Oligosacchariden und GH-A Polysaccharid-Hydrolasen mit unterschiedlichen Spezifitäten üblich. Die Struktur des BLGAL und des Oligosaccharidkomplexes bietet ein tieferes Verständnis der GH-53 Galaktanase und ist das erste kristallographische Bild eines Galaktanfragmentes oder eines beliebigen äquatorial-axial O-linked Oligosaccharids. Die Form der Substratbindungsrinne und die Verteilung der aromatischen Seitenketten auf der Oberfläche spiegeln die Form des Polysaccharid-Substrats in den Clan GH-A Enzymen wider. In BLGAL sind die Seitenketten von Trp115, Trp347 und Trp363 so angeordnet, dass sie Galaktotriose in einer helikalen Konformation binden. Es ist zu erkennen, dass die Formkomplementarität von Polysacchariden zu Polysaccharidasen eine Schlüsselrolle in der Erkennungsfunktion und Spezifität spielt.