endo-1,4-β-Galactanase

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Einleitung

Die Verarbeitung pflanzlicher Biomasse ist ein sehr wichtiges und zunehmend geschätztes industrielles Anwendungsfeld. Derzeit hat insbesondere der enzymatische Abbau pflanzlicher Zellwände erhebliches Interesse auf sich gezogen. Der Hauptbestandteil pflanzlicher Zellwände ist Pektin, das aus glatten Regionen des Homogalacturonans und „haarigen“ Regionen des Rhamnogalacturonans besteht. Rhamnogalacturonan-I ist die am häufigsten vorkommende Komponente in der haarigen Region und ein Polysaccharid, das aus alternierenden Einheiten von α-1,2-verknüpfter L-Rhamnose und α-1,4-verknüpfter D-Galacturonsäure aufgebaut ist. Die C4-Position der Rhamnose kann als Anknüpfungsstelle für Polysaccharid-Seitenketten wie Arabinan, Galactan und Arabinogalactan dienen, wodurch Rhamnogalacturonan stark verzweigt ist und eine „haarige Region“ ausbildet.

Derzeit liegen Strukturinformationen zu Rhamnogalacturonase A und Rhamnogalacturonan-Acetylesterase vor; diese Enzyme wirken auf das Rückgrat von Rhamnogalacturonan I. Darüber hinaus wurden drei β-1,4-Galactanasen (GAL) beschrieben, die auf die β-1,4-Glykosidbindungen in den Galactan- und Arabinogalactan-Seitenketten wirken. GAL gehört zur Familie 53 der Glykosidhydrolasen und ist Mitglied des Clans GH-A. Forschende haben die Struktur der pilzlichen GAL aus Aspergillus aculeatus bestimmt; sie stellt die erste verfügbare Struktur einer β-1,4-Galactanase sowie eines Enzyms der Familie 53 dar.

Gesamtstruktur von BLGAL

Die Galactanase aus Bacillus licheniformis (BLGAL) kristallisiert in der Raumgruppe P2₁; die beiden nicht-kristallographisch symmetrieverwandten Moleküle sind nahezu identisch. Die Struktur des nativen Proteins und der Komplexe ist sehr ähnlich; die Gesamtfaltung entspricht einer regulären (βα)₈-Fass-(TIM-Barrel)-Konformation. Die Schleifen nach den β-Strängen 1 und 3 sowie die lange Schleife von etwa 65 Aminosäureresten nach β-Strang 8 enthalten zusätzliche Sekundärstrukturelemente. Am oberen Ende des Barrels befindet sich ein Calciumion, das vom katalytischen Rest (>16 Å) entfernt liegt. Es wird durch Reste der beiden langen Schleifen nach β-Strang 7 (Asp272, Asp274, His276 und Asn278) und 8 (Ser367 und Asp370) koordiniert.

Abbildung 1. Stereo-Darstellung der Gesamtstruktur von BLGAL

Das aktive Zentrum und die Substratbindungsrinne

In BLGAL ist Glu165 am Ende von β-Strang 4 die katalytische Säure/Base; Glu263 am Ende von β-Strang 7 fungiert als katalytisches Nukleophil. Die in den Komplexen identifizierten Bindungsstellen für Galactobiose bzw. Galactotriose umfassen zwei Subsites (−2 und −3) bzw. drei Subsites (−2, −3 und −4). Die Reste Trp115, Trp3347 und Trp36 sind an der Substratbindung beteiligt und dienen als Plattformen für die drei Pyranoseeinheiten an den Subsites −2, −3 bzw. −4, wie in Abbildung 2 (a) und (b) dargestellt. Die detaillierten Wechselwirkungen zwischen Protein und Galactooligosacchariden sind in Abbildung 2 (c) und (d) gezeigt.

Abbildung 2. Detailansichten der Substratbindungs-Subsites −4, −3 und −2 in den finalen Modellen der Galactobiose- bzw. Galactotriose-Komplexe

Diskussion

Im Vergleich zu GAL aus Bacillus-Spezies kann die pilzliche GAL Galactan vollständiger abbauen. Die nicht-produktive Bindung kleiner Oligosaccharide an BLGAL könnte erklären, weshalb dieses Enzym β-1,4-Galactan nicht so effizient abbaut wie AAGAL. Die drei Tryptophanreste bilden die aromatische Plattform der Subsites −4, −3 und −2. Diese drei Tryptophanreste liegen im Wesentlichen parallel zum Zuckerring und stapeln sich gegen dessen α-Seite. Diese ausgeprägte parallele Wechselwirkung ist typisch für β-1,4-verknüpfte Oligosaccharide und GH-A-Polysaccharidhydrolasen mit unterschiedlichen Spezifitäten. Die Struktur des BLGAL-Oligosaccharid-Komplexes ermöglicht ein vertieftes Verständnis der GH-53-Galactanasen und stellt das erste kristallographische Abbild eines Galactanfragments bzw. eines äquatorial-axial O-verknüpften Oligosaccharids dar. Die Form der Substratbindungsrinne und die Verteilung aromatischer Seitenketten an der Oberfläche spiegeln die Gestalt des Polysaccharidsubstrats in Enzymen des Clans GH-A wider. In BLGAL sind die Seitenketten von Trp115, Trp347 und Trp363 so angeordnet, dass sie Galactotriose in einer helikalen Konformation binden. Daraus wird ersichtlich, dass die Formkomplementarität von Polysacchariden zu Polysaccharidasen eine Schlüsselrolle für Erkennungsfunktion und Spezifität spielt.