FDH

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Einleitung

NAD⁺-abhängige Formiatdehydrogenase (EC 1.2.1.2, FDH) katalysiert die Oxidation des Formiat-Ions zu Kohlendioxid und reduziert dabei gleichzeitig NAD⁺ zu NADH. Das Enzym wurde erstmals in Erbsensamen entdeckt; intensive Forschung erfolgte in den 1970er-Jahren, vor allem zur Formiatdehydrogenase aus methylotrophen Bakterien und Hefen. FDH gehört zur Superfamilie der D-spezifischen Dehydrogenasen der 2‑Hydroxycarbonsäuren, die durch ein aktives Zentrum mit ähnlicher Struktur und nahezu identischen, katalytisch essenziellen Aminosäureresten charakterisiert ist. Da dieses Enzym innerhalb der Superfamilie die einfachste Reaktion katalysiert und dabei ohne Protonenfreisetzungs- oder -abstraktionsschritte auskommt, wird FDH häufig als Modellenzym eingesetzt.

In den letzten zehn Jahren wurden FDH-Gene in verschiedenen Organismen identifiziert, darunter auch Pathogene wie Staphylococcus aureus, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis str. k10, verschiedene Stämme von Bordetella und Legionella, Histoplasma capsulatum, Cryptococcus neoformans var. neoformans JEC21, etc. Zahlreiche Studien zeigen, dass FDH unter bestimmten Bedingungen eine Schlüsselrolle für zelluläre Funktionen spielen kann. So scheint FDH in Pflanzen ein Stressprotein zu sein: Es ist in den Mitochondrien lokalisiert, und seine Biosynthese steigt unter Stressbedingungen drastisch an – bis zu 9 % des gesamten mitochondrialen Proteins. Auch die Expression des FDH-Gens ist bei pilzlichen Pathogenen stadien-/phasen­spezifisch.

Das allgemeine Schema der NAD(P)H-Regeneration für die kofaktorgekoppelte enzymatische Synthese optisch aktiver Verbindungen ist in der Abbildung dargestellt. Das Haup­tenzym E_p (Dehydrogenase, Reduktase, Monooxygenase, etc.) nutzt reduzierte Kofaktoren zur Katalyse der Bildung chiraler Verbindungen, während das zweite Enzym E_R (z. B. Formiatdehydrogenase) oxidierte Coenzyme zu NAD(P)H reduziert. Zahlreiche Befunde belegen, dass FDH zu den besten Enzymen für die Regeneration reduzierter Kofaktoren zählt. Die von FDH katalysierte Reaktion erfüllt sämtliche Kriterien für die NAD(P)H-Regeneration.

Abbildung 1. Allgemeines Schema der NAD(P)H-Regeneration für die kofaktorgekoppelte enzymatische Synthese optisch aktiver Verbindungen

Strukturanalyse als Grundlage für FDH-Engineering

Zur Auswahl der Mutationspositionen für FDH aus Pseudomonas sp.101 und die hochhomologe (Unterschied lediglich in zwei Aminosäureresten) FDH aus Mycobacterium vaccae N10 wurde eine Röntgenstrukturdatenanalyse eingesetzt. 1993 wurden hochauflösende Strukturen der Apo‑PseFDH (2NAC) sowie des ternären Komplexes (PseFDH–NAD⁺–Azid) (2NAD) bestimmt. Die Analyse der PseFDH-Struktur in Komplex mit Formiat, ADP‑Ribose, NADH sowie (NADH + Formiat) zeigte intermediäre Merkmale zwischen den Strukturen 2NAC und 2NAD, d. h. die Transformation des Apo‑Enzyms in ein Holo‑Enzym. Sämtliche Komplexe wurden mit nativem Enzym gewonnen, das aus Pseudomonas sp.101 gereinigt wurde. Das Vorhandensein von sieben zusätzlichen Aminosäureresten am C‑Terminus des rekombinanten wt‑PseFDH-Proteins beeinträchtigt die Kristallisation. Rekombinante FDH‑Kristalle wurden erfolgreich durch Entfernung dieser Reste mittels Mutagenese erhalten. Die Kristalle des vollständigen 400‑AS‑Polypeptids führten zu zwei Mutantenformen, PseFDHGAV und PseFDH T7, die eine verbesserte thermische Stabilität aufweisen.

Die Struktur des Wildtyps CboFDH konnte trotz zahlreicher Versuche nicht aufgeklärt werden. Um die erforderlichen CboFDH‑Kristalle zu erhalten, wurde ein Ansatz angewandt, der auf der Einführung von Aminosäureaustauschen in stark ungeordneten Regionen basiert. Hierzu wurden spezielle Programme sowie die Strukturen homologer Enzyme genutzt, um neue Sequenzvarianten in diesen Regionen vorherzusagen. Im Fall von CboFDH wurden mit dieser Methode die folgenden Mutationen eingeführt: Lys47Val, Lys47Glu, Arg296Ala, Lys328Val und Lys338Ala. Der Austausch Lys47Glu in CboFDH ermöglichte die Herstellung hochwertiger Kristalle; schließlich wurde eine Apo‑Enzymstruktur mit einer Auflösung von 1,9 Å erhalten. Bemerkenswert ist, dass Lys47 (Lys75 in PseFDH) in allen bislang bekannten 51 vollständigen und partiellen FDH‑Sequenzen konserviert ist.

Steigerung der katalytischen Aktivität der FDH aus C. boidinii

Einer der Nachteile von FDH ist ihre geringe katalytische Aktivität. Berichten zufolge ist die spezifische Aktivität bakterieller Enzyme relativ hoch. Bei 30 °C beträgt die spezifische Aktivität von PseFDH ca. 10 U pro mg Protein. Enzyme aus anderen Quellen sind weniger aktiv als bakterielle FDH; die Aktivität von CboFDH liegt bei ca. 6,1–6,3 U/mg (30 °C). Aufgrund der unterschiedlichen Molekülmassen dieser Enzyme (44.000 bzw. 40.370 Da für bakterielle bzw. Hefe‑Enzyme) unterscheiden sich die k_cat-Werte von PseFDH und CboFDH deutlich und betragen 7,3 bzw. 3,7 s^-1. Unter den durch Zufallsmutagenese von CboFDH erzeugten Klonen wurden Varianten mit höherer spezifischer Enzymaktivität als der Wildtyp CboFDH identifiziert. Auf Basis dieses Ergebnisses wurde CboFDH Phe285Tyr hergestellt. Diese Mutation beeinflusst die Enzymaktivität nicht, erhöht jedoch die thermische Stabilität. Der Phe285‑Rest (311 in PseFDH) befindet sich in der Position −2 relativ zum katalytisch wichtigen Gln287‑Rest (313 in PseFDH), der am Eingang des aktiven Zentrums im Bereich des Substratbindungskanals lokalisiert ist. Die durch den Austausch Phe285Ser verursachte Erhöhung der CboFDH‑Aktivität auf bis zu 9,1 U/mg beeinträchtigt die thermische Stabilität des Enzyms nicht, verschlechtert jedoch geringfügig den K_m-Wert für Coenzym und Formiat.

Abbildung 2. Position von Phe311PseFDH (Phe285CboFDH) (rosa markiert) im ternären Komplex (PseFDH–NAD+ –Azid) (Struktur 2NAD).