FDH

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Einführung

NAD⁺-abhängige Formiatdehydrogenase (EC 1.2.1.2, FDH) ist verantwortlich für die Katalyse der Oxidation des Formiat-Ions zu Kohlendioxid und gleichzeitig für die Reduktion von NAD⁺ zu NADH. Das Enzym wurde erstmals in Erbsensamen entdeckt, und in den 1970er Jahren wurde intensive Forschung betrieben, hauptsächlich zur Formiatdehydrogenase von methylotrophen Bakterien und Hefen. FDH gehört zur Superfamilie der D-spezifischen Dehydrogenasen von 2-Hydroxy-Säuren, die durch ihr aktives Zentrum gekennzeichnet ist, das eine ähnliche Struktur und fast die gleichen katalytisch wesentlichen Aminosäurereste aufweist. Da dieses Enzym die einfachste Reaktion unter den anderen Enzymen der Superfamilie katalysiert, die frei von jeglichen Protonenfreisetzungs- oder -abstraktionsschritten ist, wird FDH oft als Modellenzym gewählt.  

In den letzten zehn Jahren wurden FDH-Gene in verschiedenen Organismen entdeckt, einschließlich Pathogenen wie Staphylococcus aureus, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis str.k10, verschiedenen Stämmen von Bordetella und Legionella, Histoplasma capsulatum, Cryptococcus neoformans var. neoformans JEC21, usw. Eine große Anzahl von Studien hat gezeigt, dass FDH unter bestimmten Bedingungen eine Schlüsselrolle in der Zellfunktion spielen kann. Zum Beispiel scheint FDH ein Stressprotein in Pflanzen zu sein. Es lokalisiert sich in Mitochondrien, und seine Biosynthese steigt unter Stressbedingungen dramatisch an, bis zu 9 % des gesamten mitochondrialen Proteins. Die Expression des FDH-Gens ist auch stadien-spezifisch in pilzlichen Pathogenen.

Das allgemeine Schema der NAD(P)H-Regeneration für die kofaktor-gekoppelte enzymatische Synthese von optisch aktiven Verbindungen ist in der Abbildung dargestellt. Das Hauptenzym E_p (Dehydrogenase, Reduktase, Monooxygenase, usw.) verwendet reduzierte Cofaktoren, um die Produktion von chiralen Verbindungen zu katalysieren, während das zweite Enzym E_R (wie Formiatdehydrogenase) oxidierte Coenzyme zu NAD(P)H reduziert. Viele Beweise deuten darauf hin, dass FDH eines der besten Enzyme zur Regeneration reduzierter Cofaktoren ist. Die Reaktion, die von FDH katalysiert wird, erfüllt alle Kriterien für die NAD(P)H-Regeneration.

Abbildung 1. Allgemeines Schema der NAD(P)H-Regeneration für die kofaktor-gekoppelte enzymatische Synthese von optisch aktiven Verbindungen

Strukturanalyse angewandt auf FDH-Engineering

X-ray-Datenanalyse wurde verwendet, um die Mutationspositionen für FDH von Pseudomonas sp.101 und die hoch homologe (unterscheidet sich nur in zwei Aminosäureresten) FDH von Mycobacterium vaccae N10 auszuwählen. Im Jahr 1993 wurden hochauflösende Strukturen von apo-PseFDH (2NAC) und ternärem Komplex (PseFDH NAD⁺-Azid) (2NAD) erhalten. Die Analyse der PseFDH-Struktur im Komplex mit Formiat, ADP-Ribose, NADH und (NADH + Formiat) offenbarte ihr intermediäres Merkmal zwischen den 2NAC- und 2NAD-Strukturen, d.h. die apo-Enzym-Transformation in ein holo-Enzym. Alle Komplexe wurden mit dem nativen Enzym, das aus Pseudomonas sp.101 gereinigt wurde, erhalten. Die Anwesenheit von sieben zusätzlichen Aminosäureresten am C-Terminus des rekombinanten wt-PseFDH-Proteins stört die Kristallisation. Rekombinante FDH-Kristalle wurden erfolgreich durch Entfernen dieser Reste durch Mutagenese erhalten. Die vollwertigen 400 aa Polypeptidkristalle haben zwei Mutantenformen hervorgebracht, nämlich PseFDHGAV und PseFDH T7, die eine verbesserte thermische Stabilität aufweisen.

Wissenschaftler haben nach vielen Versuchen die Strukturdaten des Wildtyps CboFDH nicht auflösen können. Um die erforderlichen CboFDH-Kristalle zu erhalten, wurde eine Methode angewandt, die auf der Einführung von Aminosäureersatz in den hoch ungeordneten Regionen basiert. Verwenden Sie spezielle Programme und die Struktur homologer Enzyme, um neue Enzyme in diesen Regionen vorherzusagen. Im Fall von CboFDH wird diese Methode verwendet, um die folgenden Mutationen einzuführen: Lys47Val, Lys47Glu, Arg296Ala, Lys328Val und Lys338Ala. Der Ersatz Lys47Glu in CboFDH bereitete erfolgreich hochwertige Kristalle vor und schließlich wurde eine apo-Enzymstruktur mit einer Auflösung von 1,9 Å erhalten. Es ist erwähnenswert, dass Lys47 (Lys75 in PseFDH) in allen 51 bekannten vollständigen und teilweisen FDH-Sequenzen konserviert ist.

Steigerung der katalytischen Aktivität von FDH aus C. boidinii

Einer der Nachteile von FDH ist seine niedrige katalytische Aktivität. Berichten zufolge ist die spezifische Aktivität von bakteriellen Enzymen relativ hoch. Bei 30 °C beträgt die spezifische Aktivität von PseFDH ca. 10 U pro mg Protein. Enzyme aus anderen Quellen sind nicht so aktiv wie bakterielle FDH, und die Aktivität von CboFDH beträgt ca. 6,1-6,3 U/mg (30 °C). Aufgrund der unterschiedlichen Molekularmasse dieser Enzyme (44.000 und 40.370 Da für bakterielle und Hefenzyme) sind die Werte von k_cat von PseFDH und CboFDH sehr unterschiedlich, 7,3 und 3,7 s^-1 jeweils. Unter den Klonen, die durch zufällige Mutation von CboFDH erzeugt wurden, wurden Klone mit einer höheren spezifischen Enzymaktivität als das Wildtyp-CboFDH identifiziert. Basierend auf diesem Ergebnis haben Wissenschaftler CboFDH Phe285Tyr produziert. Die Mutation hat keinen Einfluss auf die Enzymaktivität, erhöht jedoch die thermische Stabilität. Das Phe285 (311 PseFDH) Rest in FDH befindet sich in - 2 Position im Verhältnis zu dem katalytisch wichtigen Gln287 (313 PseFDH) Rest, der sich am Eingang des aktiven Zentrums des Enzyms an der Stelle des Substratbindungskanals befindet. Die Erhöhung der CboFDH-Aktivität durch den Ersatz von Phe285Ser um bis zu 9,1 U/mg wird die thermische Stabilität des Enzyms nicht beeinträchtigen, verschlechtert jedoch leicht den K_m Wert des Coenzyms und des Formiats.

Abbildung 2. Position von Phe311PseFDH (Phe285CboFDH) (markiert durch rosa Farbe) im ternären Komplex (PseFDH-NAD+ -Azid) (Struktur 2NAD).