Galactose-Oxidase

Galactose-Oxidase (GO, GAO, EC 1.1.3.9) ist ein mononukleares Kupferenzym, das die Zwei-Elektronen-Oxidation einer großen Anzahl von primären Alkoholen zu ihren entsprechenden Aldehyden katalysiert, gekoppelt mit der Reduktion von Dioxygen zu Wasserstoffperoxid. Das Protein ist ein einzelnes Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 65-68 kDa. GO kann in drei verschiedene Oxidationszustände existieren: der höchste Zustand mit Cu(II) und Tyrosylradikal, der Zwischenzustand mit Cu(II) und Tyrosin und der niedrigste Zustand mit Cu(I) und Tyrosin. Die Nutzung von GAO ist in Biosensoren und anderen analytischen Techniken zur Detektion von Galactose und galactosehaltigen Sacchariden, wie Laktose, möglich. Für Anwendungen in der chemischen Synthese wurden verschiedene neue Mono-, Oligo- und Polysaccharidderivate durch die GAO-katalysierte Oxidation hergestellt.

Struktur

Die Struktur der Galactose-Oxidase wurde umfassend untersucht. Die Galactose-Oxidase enthält 639 Aminosäuren. Sie hat drei Domänen mit einem einzelnen Kupfer(II)-Ion, das sich in einem Bereich nahe der Oberfläche der β-Propeller-Domäne befindet, in der Nähe der pseudo siebenfachen Achse. Domäne 1 (Reste 1-155) ist ein β-Sandwich, das aus acht antiparallelen β-Strängen besteht. Es enthält eine mögliche Bindungsstelle für Na⁺ oder Ca²⁺, die strukturelle Rollen im Protein spielen könnte. Ein weiteres Merkmal von Domäne 1 ist das Vorhandensein einer Kohlenhydrat-Bindungsstelle, die das Enzym anregt, an extrazelluläre Kohlenhydrate zu binden. Domäne 2 (Reste 156-552) enthält die Kupfer-Bindungsstelle. Die β-Stränge in Domäne 2 sind als siebenfacher Propeller organisiert, und jede der sieben strukturellen Einheiten ist ein Subdomäne, die aus vier antiparallelen β-Strängen besteht. Domäne 3 (Reste 553-639) besteht aus sieben antiparallelen β-Strängen und bildet eine „Kappe“ über Domäne 2. Ein Histidin (His581) von Domäne 3 dient als Ligand für Kupfer und trägt zur metallhaltigen aktiven Stelle des Enzyms bei.

Die Kristallform, die in Acetatpuffer bei pH 4,5 gewachsen ist, zeigt, dass die Kupferstelle quadratisch-pyramidal ist, mit Tyr272, His496, His581 und einem Acetat-Ion als äquatorialen Liganden und Tyr495 als axialem Liganden. Eine ungewöhnliche Thioetherbindung existiert zwischen einem der C-Kohlenstoffe des Tyr272-Rings und dem Sg von Cys228 in der aktiven Stelle. Eine erweiterte aromatische Region wird durch die ko-planaren Seitenketten von Tyr272 und Cys228 gebildet, die mit dem Indolring von Trp290 gestapelt sind. In Kristallen, die bei pH 4,5 in Acetat gewachsen sind und dann in einen Puffer bei pH 7,0 ohne Acetat übertragen wurden, bleibt die Struktur der Kupferstelle im Wesentlichen unverändert, abgesehen von der Ersetzung des Acetat-Ions durch Wasser.

Wirkmechanismus

Das Enzym katalysiert eine Zwei-Elektronen-Redoxreaktion gemäß dem allgemeinen Schema: RCH₂OH+O₂→RCHO+H₂O₂. Der katalytische Mechanismus der Galactose-Oxidase besteht aus vier Hauptphasen. In der ersten Phase wird das Substrat durch das doppelte Redoxzentrum oxidiert. Die Hydroxylgruppe wird von Tyr495 deprotoniert, nachdem die Lösungsmittel-Koordinationsstelle von der Hydroxylgruppe des Substratalkohols besetzt ist, gefolgt von der Freisetzung von Tyr495. Dieser Schritt macht den Alkohol anfälliger für die Oxidation. Das Proton auf dem Kohlenstoff, das für den angehängten Kohlenstoff verwendet wird, wird dann in Kombination mit der Oxidation des Substrats an Tyr272 übertragen. Ein Elektron geht zum Kupfer(II)-Zentrum, das dann zu Kupfer(I) reduziert wird, das andere Elektron geht an den radikalen Liganden. In der Zwischenzeit wird das Tyr272-Radikal ebenfalls reduziert. Das Ergebnis der ersten Phase ist die Entfernung von zwei Elektronen und die Entfernung von zwei Wasserstoffatomen vom Substrat. Die zweite Phase ist die Freisetzung des oxidierten Substrats und die Koordination von Dioxygen an der Substrat-Koordinationsstelle. Die dritte Phase ist die schnelle Reduktion von Dioxygen durch Kupfer(I) zur Bildung von Superoxid. Die vierte Phase ist die Deprotonierung von Tyr496 durch Hydroperoxid, das als H₂O₂ freigesetzt wird. Die anschließende axiale Koordination von Tyr496 und die äquatoriale Koordination des neuen Substratmoleküls zum Kupferzentrum vervollständigen den Umsatz des Enzyms.

Abbildung 2. Katalytischer Mechanismus der Galactose-Oxidase.

Es ist klar, dass Galacto-Aldehyde die Hauptprodukte der GAO-katalysierten Oxidation sind. Allerdings können auch mehrere Nebenprodukte entstehen. Zum Beispiel konnten nach 72 Stunden Oxidation von Methyl α-D-Galactopyranosid durch GAO 27% der Produkte nicht identifiziert werden. In anderen Studien wurden einige der Nebenprodukte identifiziert und charakterisiert, wie ein α,β-ungesättigter Aldehyd. Neben der Bildung von GAO-generierten Nebenprodukten führt die hohe Reaktivität der Hauptaldehydprodukte zur Bildung von Hydraten und Hemiacetalen durch reversible Reaktionen. Dieses Phänomen muss insbesondere bei der Quantifizierung des Oxidationsgrades berücksichtigt werden.

Anwendungen

Verschiedene Immobilisierungstechniken wurden in Biosensorstudien unter Verwendung von GAO eingesetzt. Zum Beispiel wurde GAO innerhalb eines Laponit-Tonfilms immobilisiert, der auf einer Pt-Elektrodenoberfläche beschichtet ist, um einen multifunktionalen amperometrischen Sensor zu konstruieren. Mit Di-Isothiocyanat-Stilben als Brückenverbindung wurde GAO auch an Monolayer von aminisierten Thiolen auf Au- oder Ag-Oberflächen angeheftet, wobei das Stilben eine Quervernetzung zwischen den Aminogruppen von sowohl GAO als auch den Thiolbeschichtungen schafft.

Galactose ist kein essentielles Nährstoff für den Menschen, kann jedoch als Energiequelle oder in der Biosynthese einiger Biomoleküle, wie Glykolipiden und Glykoproteinen, genutzt werden. Dementsprechend kann ein Mangel an den Enzymen, die am Metabolismus von Galactose beteiligt sind, zu Gesundheitsproblemen führen, wie Hepatosplenomegalie, Blutungsstörungen, Escherichia coli-Sepsis und Katarakt. Daher wurden Galactose-Biosensoren insbesondere für Serumproben entwickelt. GAO-basierte Biosensoren haben auch Untersuchungen zur Protein-Glykosylierung erleichtert. Immobilisierte GAO oxidierte und markierte somit galactose-terminierte Glykane, die dann durch NaBD₄ reduziert und mit LC-MS analysiert oder mit Aminooxy-Biotin markiert und mit MS/MS analysiert werden konnten. Ein ähnlicher Ansatz wurde in der chemilumineszenten Bildgebung der Glykanausdrücke verwendet.

Umweltanwendungen von GAO umfassen die O₂-Entfernung, die für die vor Ort Überwachung von Nitrat-Ionen in Wasser oder Boden durch elektrochemische Analyse erforderlich ist, da Nitrat von nitratreduzierenden Bakterien unter anaeroben Bedingungen verbraucht wird. Die Zugabe von GAO, Glukose-Oxidase oder Pyranose 2-Oxidase mit den geeigneten Substraten und Katalase entfernte O₂ vollständig aus den Proben in 1h.

Referenzen