Galactoseoxidase

Galactoseoxidase (GO, GAO, EC 1.1.3.9) ist ein mononukleäres Kupferenzym, das die Zwei-Elektronen-Oxidation einer großen Zahl primärer Alkohole zu den entsprechenden Aldehyden katalysiert, gekoppelt an die Reduktion von Disauerstoff zu Wasserstoffperoxid. Das Protein besteht aus einer einzelnen Polypeptidkette mit einem Molekulargewicht von 65–68 kDa. GO kann in drei unterschiedlichen Oxidationszuständen vorliegen: im höchsten Zustand mit Cu(II) und Tyrosylradikal, im intermediären Zustand mit Cu(II) und Tyrosin sowie im niedrigsten Zustand mit Cu(I) und Tyrosin. Der Einsatz von GAO ist in Biosensoren und anderen analytischen Verfahren zur Detektion von Galactose und galactosehaltigen Sacchariden, wie z. B. Lactose, möglich. Für Anwendungen in der chemischen Synthese wurden durch GAO-katalysierte Oxidation verschiedene neue Mono-, Oligo- und Polysaccharidderivate hergestellt.

Struktur

Die Struktur der Galactoseoxidase wurde umfassend untersucht. Galactoseoxidase umfasst 639 Aminosäuren. Sie besitzt drei Domänen mit einem einzelnen Kupfer(II)-Ion, das in einer nahe der Oberfläche der β-Propeller-Domäne gelegenen Bindungsstelle in der Nähe der pseudo-siebenfachen Achse lokalisiert ist. Domäne 1 (Reste 1–155) ist ein β-Sandwich aus acht antiparallelen β-Strängen. Sie enthält eine potenzielle Bindungsstelle für Na⁺ oder Ca²⁺, die möglicherweise strukturelle Funktionen im Protein erfüllt. Ein weiteres Merkmal von Domäne 1 ist das Vorhandensein einer Kohlenhydrat-Bindungsstelle, die das Enzym zur Bindung an extrazelluläre Kohlenhydrate dirigiert. Domäne 2 (Reste 156–552) enthält die Kupferbindungsstelle. Die β-Stränge in Domäne 2 sind als siebenfacher Propeller organisiert, wobei jede der sieben Struktureinheiten eine Subdomäne aus vier antiparallelen β-Strängen darstellt. Domäne 3 (Reste 553–639) besteht aus sieben antiparallelen β-Strängen und bildet eine „Kappe“ über Domäne 2. Ein Histidin (His581) aus Domäne 3 dient als Ligand für Kupfer und trägt damit zur metallhaltigen aktiven Stelle des Enzyms bei.

Die in Acetatpuffer bei pH 4,5 gewachsene Kristallform zeigt, dass die Kupferbindungsstelle quadratisch-pyramidal koordiniert ist, mit Tyr272, His496, His581 und einem Acetat-Ion als äquatorialen Liganden sowie Tyr495 als axialem Liganden. Im aktiven Zentrum besteht eine ungewöhnliche Thioetherbindung zwischen einem der C-Atome des Tyr272-Rings und dem Sγ von Cys228. Eine ausgedehnte aromatische Region wird durch die koplanaren Seitenketten von Tyr272 und Cys228 gebildet, die mit dem Indolring von Trp290 stapeln. In Kristallen, die bei pH 4,5 in Acetat gezüchtet und anschließend in einen bei pH 7,0 gepufferten, acetatfreien Puffer überführt wurden, bleibt die Struktur der Kupferbindungsstelle im Wesentlichen unverändert, mit Ausnahme des Austauschs des Acetat-Ions durch Wasser.

Wirkmechanismus

Das Enzym katalysiert eine Zwei-Elektronen-Redoxreaktion gemäß dem allgemeinen Schema: RCH₂OH+O₂→RCHO+H₂O₂. Der katalytische Mechanismus der Galactoseoxidase umfasst vier Hauptphasen. In der ersten Phase wird das Substrat durch das doppelte Redoxzentrum oxidiert. Nachdem die Lösungsmittel-Koordinationsstelle durch die Hydroxylgruppe des Substratalkohols besetzt ist, wird die Hydroxylgruppe durch Tyr495 deprotoniert, gefolgt von der Abdissoziation von Tyr495. Dieser Schritt erhöht die Oxidierbarkeit des Alkohols. Das Proton am Kohlenstoff, der das gebundene Kohlenstoffatom trägt, wird anschließend in Kombination mit der Oxidation des Substrats auf Tyr272 übertragen. Ein Elektron wird auf das Kupfer(II)-Zentrum übertragen, das dadurch zu Kupfer(I) reduziert wird; das andere Elektron wird auf den Radikal-Liganden übertragen. Gleichzeitig wird auch das Tyr272-Radikal reduziert. Ergebnis der ersten Phase ist die Entfernung von zwei Elektronen sowie von zwei Wasserstoffatomen aus dem Substrat. In der zweiten Phase erfolgt die Freisetzung des oxidierten Substrats und die Koordination von Disauerstoff an der Substrat-Koordinationsstelle. In der dritten Phase wird Disauerstoff durch Kupfer(I) rasch reduziert und es entsteht Superoxid. In der vierten Phase wird Tyr496 durch Hydroperoxid deprotoniert, das als H₂O₂ freigesetzt wird. Die anschließende axiale Koordination von Tyr496 und die äquatoriale Koordination eines neuen Substratmoleküls an das Kupferzentrum schließen den katalytischen Umsatz des Enzyms ab.

Abbildung 2. Katalytischer Mechanismus der Galactoseoxidase.

Es ist klar, dass Galactoaldehyde die Hauptprodukte der GAO-katalysierten Oxidation sind. Es können jedoch auch mehrere Nebenprodukte entstehen. So konnten beispielsweise nach 72-stündiger Oxidation von Methyl-α-D-galactopyranosid durch GAO 27 % der Produkte nicht identifiziert werden. In anderen Studien wurden einige der Nebenprodukte identifiziert und charakterisiert, wie etwa ein α,β-ungesättigtes Aldehyd. Zusätzlich zur Bildung GAO-generierter Nebenprodukte führt die hohe Reaktivität der Hauptaldehydprodukte zur Bildung von Hydraten und Halbacetalen durch reversible Reaktionen. Dieses Phänomen muss insbesondere bei der Quantifizierung des Oxidationsgrades berücksichtigt werden.

Anwendungen

In Biosensorstudien mit GAO wurden verschiedene Immobilisierungstechniken eingesetzt. Beispielsweise wurde GAO in einem Laponit-Tonfilm immobilisiert, der auf die Oberfläche einer Pt-Elektrode aufgebracht wurde, um einen multifunktionalen amperometrischen Sensor zu konstruieren. Unter Verwendung von Diisothiocyanat-Stilben als Brückenverbindung wurde GAO zudem an Monolagen aminierter Thiole auf Au- oder Ag-Oberflächen gekoppelt, wobei das Stilben eine Quervernetzung zwischen den Aminogruppen von GAO und den Thiolbeschichtungen erzeugt.

Galactose ist für den Menschen kein essenzieller Nährstoff, kann jedoch als Energiequelle oder in der Biosynthese bestimmter Biomoleküle wie Glykolipide und Glykoproteine genutzt werden. Entsprechend kann ein Mangel an Enzymen, die am Galactosestoffwechsel beteiligt sind, zu gesundheitlichen Problemen führen, z. B. Hepatosplenomegalie, Blutungsstörungen, Escherichia-coli-Sepsis und Katarakt. Daher wurden Galactose-Biosensoren insbesondere für Serumproben entwickelt. GAO-basierte Biosensoren haben zudem Untersuchungen zur Proteinglykosylierung erleichtert. Immobilisierte GAO oxidierte und markierte dadurch galactose-terminierte Glycane, die anschließend mit NaBD₄ reduziert und mittels LC-MS analysiert oder mit Aminooxy-Biotin markiert und mittels MS/MS untersucht werden konnten. Ein ähnlicher Ansatz wurde bei der chemilumineszenten Bildgebung der Glykanexpression eingesetzt.

Zu den Umweltanwendungen von GAO gehört die Entfernung von O2, die für die Vor-Ort-Überwachung von Nitrat-Ionen in Wasser oder Boden mittels elektrochemischer Analyse erforderlich ist, da Nitrat unter anaeroben Bedingungen von nitratreduzierenden Bakterien verbraucht wird. Die Zugabe von GAO, Glucoseoxidase oder Pyranose-2-Oxidase zusammen mit geeigneten Substraten und Katalase entfernte O2 innerhalb von 1 h vollständig aus den Proben.

Literatur