GK

Verwandte Lektüre

Einführung

In den meisten Bakterien wird die Glycerolaufnahme auf energieunabhängige Weise durch ein Membrankanalprotein, den Glycerol-Fazilitator (GlpF), katalysiert. Die treibende Kraft der Glyceroldiffusion resultiert aus dem Ungleichgewicht der intra- und extrazellulären Glycerolkonzentration, das durch den Glycerolstoffwechsel verursacht wird. Typischerweise wandelt Glycerolkinase (GlpK) Triole in Glycerol-3-P (G3P) um, und da G3P von GlpF nicht als Substrat erkannt wird, spielt GlpK eine integrale Rolle bei der intrazellulären Erfassung von Glycerol. Bei Firmicutes (grampositive) und Enterobacteriaceae (gramnegative) wird die Synthese von GlpK durch Kohlenstoffkatabolitenhemmung kontrolliert, und die enzymatische Aktivität wird durch das Zucker-Phosphotransferase-System (PTS) reguliert. PTS ist ein Kohlenhydrattransport- und Phosphorylierungssystem, bei dem vier der fünf Proteine (oder Domänen) Phosphoenolpyruvat (PEP) als Phosphatdonor verwenden, um eine Phosphorylierungskaskade zu bilden. In in vivo-Studien führte die Anwesenheit von PTS-Zuckern zu einer schlechten Phosphorylierung von PTS-Proteinen und verringerte auch signifikant das Ausmaß der GlpK-Phosphorylierung und -Aktivierung in Glycerol.

Überraschenderweise sind, obwohl diese Enzyme typischerweise eine Sequenzidentität von 50% bis 60% aufweisen, die Mechanismen, die die GlpK-Aktivität steuern, bei Firmicutes und Enterobacteriaceae ziemlich unterschiedlich. Bei Enterobacteriaceae wie E. coli interagiert unphosphoryliertes EIIA^Glc mit GlpK und hemmt dessen Aktivität, wodurch die Biosynthese des Induktors G3P verhindert wird. Die Interaktion von EIIA^Glc mit GlpK erfolgt im C-terminalen Bereich, etwa 30 Å vom Glycerolbindungsort entfernt, und wird durch die Anwesenheit von Zn²⁺-Ionen stimuliert. Bei Firmicutes-GlpK befindet sich die Aktivierungsschleife ebenfalls entfernt vom aktiven Zentrum, wie in der Kristallstruktur gezeigt. Mehrere spontane Mutationen in Bacillus subtilis führen zur Glycerolnutzung in Abwesenheit eines funktionalen PTS. GlpK von B. subtilis wird an His-230 phosphoryliert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die oben genannten Mutationen und die GlpK-Phosphorylierung ähnliche strukturelle Veränderungen verursachen, die zur Aktivierung des Enzyms führen. Mutantes GlpK, das aus E. casseliflavus und B. subtilis isoliert wurde, zeigte eine 7- bis 19-fach höhere Aktivität als das unphosphorylierte Wildtyp (WT)-Enzym.

Abbildung 1. Übersicht über das Enterococcus casseliflavus GlpK O-X Dimer (Yeh, J.I.; et al. 2009)

Katalytische Stelle

Die Bindung von Glycerol an GlpK ist eine geordnete Reaktion, bei der Glycerol zuerst bindet, gefolgt von ATP. Obwohl die meisten Studien am E. coli GlpK-Enzym durchgeführt wurden, wurde eine Sequenzkonservierung der katalytischen Spaltreste über Organismen hinweg festgestellt, während eine größere Sequenzvielfalt in den regulatorischen Regionen von GlpK gefunden wurde. Daher könnten die Konfiguration der aktiven Stelle und der katalytische Mechanismus verschiedener GlpK-Enzyme ähnlich sein.

Glycerol wird tief innerhalb der katalytischen Spalte durch Wasserstoffbrückenbindungen zu mehreren Resten gebunden. Die starke Elektronendichte, die in den Fo-Fc-Karten der glycerolgebundenen katalytischen Spalte evident ist, unterstützt die Anwesenheit eines einzelnen Glycerolmoleküls pro Untereinheit. Die aktiven Stellen His232Arg, His232Glu und His232Ala weisen starke Ähnlichkeiten um die Glycerolbindungsstelle auf, und die Wasserstoffbindungsdistanzen zwischen Glycerol und Aminosäuren in den aktiven Stellen unterscheiden sich um weniger als 0,2 Å. An der aktiven Stelle sind mit Hilfe von Glu85, Arg84, Asp 246 und Tyr136 für das Verankern und Ausrichten des gebundenen Glycerols verantwortlich. Die Reste Trp104 und Phe271 bieten hydrophobe Oberflächen, um mit den Glycerolkohlenstoffen zu interagieren und das Glycerol weiter auszurichten. Die Ähnlichkeit zwischen den Orientierungen der aktiven Stellenreste in allen GlpK-Strukturen deutet darauf hin, dass Unterschiede in der Aktivität nicht auf direkte Veränderungen der Glycerolbindung an der katalytischen Spalte zurückzuführen sind.

Die Bindung von GlpK an das Substrat führt zum Schließen der katalytischen Spalte, wodurch die Domänen I und II näher zusammengebracht werden. Glycerol bindet tief innerhalb der katalytischen Spalte, während sich die vermutete ATP-Bindungsstelle am Eingang der katalytischen Spalte befindet. Während Glycerol leicht an der aktiven Stelle identifiziert werden kann, wurden zusätzliche signifikante positive Rest-Elektronendichten in den Differenzdichtkarten von His232Arg, His232Arg-B und His232Glu gefunden, die darauf hinweisen, dass das tetragonale Molekül nahe bei Glycerol ist, an der Position, die die Glycerol- und ATP-Bindungsstellen verbindet. Basierend auf den Kristallisationsbedingungen jedes Proteins wurde ein Phosphat-Ion als His232Arg-Dichte modelliert, während Sulfationen in His232Glu und His232Arg-B platziert wurden. Nach der Verfeinerung ist die Phosphatgruppe 4,4 Å vom Glycerol-O3-Atom entfernt, während das Sulfat 4,8 Å (His232Glu) und 3,5 Å (His232Arg-B) entfernt ist.

Abbildung 2. Glycerolbindungsstelle in His232Arg und His232Glu GlpK-Mutanten (Yeh, J.I.; et al. 2009)