GK

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Einleitung

In den meisten Bakterien wird die Glycerolaufnahme energieunabhängig durch ein Membrankanalkomplexprotein, den Glycerolfazilitator (GlpF), katalysiert. Die Triebkraft der Glyceroldiffusion beruht auf dem Ungleichgewicht der intra- und extrazellulären Glycerolkonzentration, das durch den Glycerolstoffwechsel verursacht wird. Typischerweise wandelt die Glycerolkinase (GlpK) Triole in Glycerol-3-Phosphat (G3P) um; da G3P von GlpF nicht als Substrat erkannt wird, spielt GlpK eine integrale Rolle bei der intrazellulären „Abfangung“ von Glycerol. In Firmicutes (grampositiv) und Enterobacteriaceae (gramnegativ) wird die GlpK-Synthese durch Kohlenstoffkatabolitrepression gesteuert, und die enzymatische Aktivität wird durch das Zucker-Phosphotransferase-System (PTS) reguliert. Das PTS ist ein System für Kohlenhydrattransport und -phosphorylierung, bei dem vier seiner fünf Proteine (bzw. Domänen) Phosphoenolpyruvat (PEP) als Phosphatdonor nutzen, um eine Phosphorylierungskaskade zu bilden. In in vivo-Studien führte die Anwesenheit von PTS-Zuckern zu einer geringen Phosphorylierung der PTS-Proteine und reduzierte zudem signifikant das Ausmaß der GlpK-Phosphorylierung und -Aktivierung in Gegenwart von Glycerol.

Überraschenderweise sind die Mechanismen, die die GlpK-Aktivität steuern, in Firmicutes und Enterobacteriaceae trotz einer typischen Sequenzidentität dieser Enzyme von 50 % bis 60 % deutlich unterschiedlich. In Enterobacteriaceae wie E. coli interagiert unphosphoryliertes EIIA^Glc mit GlpK und inhibiert deren Aktivität, wodurch die Biosynthese des Induktors G3P verhindert wird. Die Interaktion von EIIA^Glc mit GlpK erfolgt in der C-terminalen Domäne etwa 30 Å von der Glycerol-Bindungsstelle entfernt und wird durch die Anwesenheit von Zn²⁺-Ionen stimuliert. Bei GlpK aus Firmicutes ist die Aktivierungsschleife, wie in der Kristallstruktur gezeigt, ebenfalls vom aktiven Zentrum entfernt lokalisiert. Mehrere spontane Mutationen in Bacillus subtilis führen zu einer Glycerolverwertung in Abwesenheit eines funktionellen PTS. GlpK aus B. subtilis wird an His-230 phosphoryliert. Diese Befunde legen nahe, dass die genannten Mutationen und die GlpK-Phosphorylierung vergleichbare strukturelle Veränderungen verursachen, die zur Aktivierung des Enzyms führen. Mutante GlpK, gereinigt aus E. casseliflavus und B. subtilis, zeigte eine 7- bis 19-fach höhere Aktivität als das unphosphorylierte Wildtyp-(WT-)Enzym.

Abbildung 1. Überblick über das Enterococcus-casseliflavus-GlpK-O-X-Dimer (Yeh, J.I.; et al. 2009)

Katalytische Bindungsstelle

Die Bindung von Glycerol an GlpK ist eine geordnete Reaktion, wobei zunächst Glycerol und anschließend ATP bindet. Obwohl die meisten Studien am GlpK-Enzym aus E. coli durchgeführt wurden, wurde eine Konservierung der Aminosäurereste der katalytischen Spalte über verschiedene Organismen hinweg festgestellt, während in regulatorischen Regionen von GlpK eine größere Sequenzdiversität vorliegt. Daher könnten die Konfiguration des aktiven Zentrums und der katalytische Mechanismus verschiedener GlpK-Enzyme ähnlich sein.

Glycerol ist tief in der katalytischen Spalte gebunden und bildet Wasserstoffbrücken zu mehreren Aminosäureresten. Die ausgeprägte Elektronendichte in Fo-Fc-Karten der glycerolgebundenen katalytischen Spalte stützt das Vorliegen eines einzelnen Glycerolmoleküls pro Untereinheit. Die aktiven Zentren der Varianten His232Arg, His232Glu und His232Ala weisen im Bereich der Glycerol-Bindungsstelle starke Ähnlichkeiten auf, und die Wasserstoffbrückenabstände zwischen Glycerol und Aminosäuren in den aktiven Zentren unterscheiden sich um weniger als 0,2 Å. Im aktiven Zentrum sind – unter Mitwirkung von Glu85 – Arg84, Asp246 und Tyr136 für die Verankerung und Ausrichtung des gebundenen Glycerols verantwortlich. Die Reste Trp104 und Phe271 stellen hydrophobe Oberflächen bereit, die mit den Glycerol-Kohlenstoffatomen interagieren und so die Ausrichtung des Glycerols weiter stabilisieren. Die Ähnlichkeit der Orientierungen der aktiven-Zentrum-Reste in allen GlpK-Strukturen legt nahe, dass Aktivitätsunterschiede nicht auf direkte Veränderungen der Glycerolbindung in der katalytischen Spalte zurückzuführen sind.

Die Bindung von GlpK an das Substrat führt zum Schließen der katalytischen Spalte und bringt dadurch die Domänen I und II näher zusammen. Glycerol bindet tief innerhalb der katalytischen Spalte, während die mutmaßliche ATP-Bindungsstelle am Eingang der katalytischen Spalte lokalisiert ist. Während Glycerol im aktiven Zentrum eindeutig identifiziert werden kann, wurden in den differentiellen Dichtekarten von His232Arg, His232Arg-B und His232Glu zusätzliche signifikante positive Restelektronendichten gefunden, die darauf hinweisen, dass sich das tetragonale Molekül in der Nähe von Glycerol befindet – an einer Position, die die Glycerol- und ATP-Bindungsstellen überbrückt. Auf Grundlage der Kristallisationsbedingungen jedes Proteins wurde in der His232Arg-Dichte ein Phosphat-Ion modelliert, während in His232Glu und His232Arg-B Sulfat-Ionen platziert wurden. Nach der Verfeinerung liegt die Phosphatgruppe 4,4 Å vom Glycerol-O3-Atom entfernt, während das Sulfat 4,8 Å (His232Glu) bzw. 3,5 Å (His232Arg-B) entfernt ist.

Abbildung 2. Glycerol-Bindungsstelle in den GlpK-Mutanten His232Arg und His232Glu (Yeh, J.I.; et al. 2009)