Glukose-Dehydrogenase

Die Glukose-Dehydrogenase katalysiert die Oxidation von β-D-Glukose zu β-D-Glukose-1,5-Lacton, während sie den Cofaktor NADP⁺ zu NADPH reduziert, oder in geringerem Maße NAD⁺ zu NADH. Das Enzym ist in einer Vielzahl von Organismen vorhanden, wie Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Gluconobacter suboxydans, Halobacterium mediterranean, Acidophilus und Thiobacillus. Die Glukose-Dehydrogenase akzeptiert NADP⁺ und NAD⁺ als Cofaktoren. Daher ist dieses Enzym ein guter Kandidat für die Regeneration von NADPH oder NADH. Dies ist von Interesse für die asymmetrische Reduktion von prochiralen Ketonen, um chirale Hydroxylgruppen oder Aminosäuren oder Alkohole zu produzieren, die wichtige Rohstoffe und Ausgangsmaterialien für die Synthese wichtiger Substanzen sind. Die meisten derzeit verwendeten Oxidoreduktasen hängen von Nicotinamid-Coenzymen ab. Für die Regeneration von NADH hat die auf Formiat/Formiat-Dehydrogenase (FDH) basierende Methode die höchste Entwicklungsstufe erreicht.

Abbildung 1. Proteinstruktur der Glukose-Dehydrogenase.

Beziehung zwischen Struktur und Funktion der Glukose-Dehydrogenase

Obwohl die Glukose-Dehydrogenase aus verschiedenen Quellen ähnliche Funktionen hat, gibt es bestimmte Unterschiede in ihrer Primärstruktur und räumlichen Struktur. Beim Vergleich der Homologie der Glukose-Dehydrogenase, die aus Bacillus megaterium und Bacillus subtilis stammt, wurde festgestellt, dass 23 strukturelle Gene Übergänge, 30 Transversionen, 1 Inversion und 3 Insertionen oder Deletionen aufwiesen, jedoch keine Verschiebungen gefunden wurden. Die Homologie der beiden Enzymuntereinheiten beträgt 85 %, was die ähnliche evolutionäre Zeit der beiden widerspiegelt.

Quelle der Glukose-Dehydrogenase

Derzeit gewinnen Forscher im In- und Ausland dieses Enzym hauptsächlich aus der Fermentation von Rinderherz und verschiedenen Mikroorganismen, wie Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, calciumacetat-immobilisiertem Bacillus (Acinetobacter calcoaceticus) halophilen Archaebakterien (hala. (Thermoacidophilis-Archaebakterium) usw. Transketolase-defiziente (thermoacidophilis-Archaebakterium) usw. Transketolase-defiziente Bacillus subtilis-abgeleitete DH ist aufgrund ihrer hohen Enzymproduktionskapazität leicht zu reinigen und wird von den Menschen weit akzeptiert und angewendet.

Trennung, Reinigung und kinetische Eigenschaften der Glukose-Dehydrogenase

Derzeit wird aus dem Ausland hochergiebige QH allgemein durch Klonierung des Gens gewonnen, das in E. coli-Expressionswirtbakterien transformiert und durch Fermentation von Mikroorganismen erhalten wird. Als intrazelluläres Enzym muss zur Untersuchung von DH der zellfreie Extrakt durch Zellaufschluss hergestellt werden, um die Enzymaktivität zu bestimmen. Unter Berücksichtigung der Zerkleinerungseffizienz und der Besonderheit des Enzymproteins wird häufig die inländische Gefrier-Tau-Methode oder die Ultraschall-Zerkleinerungsmethode verwendet. Einige Menschen im Ausland verwenden fortschrittliche Hochdruck-Zellzerstörer für die Glukose-Dehydrogenase aus verschiedenen Quellen. Obwohl ihre katalytischen Aktivitäten sehr ähnlich sind, sind ihre Strukturen unterschiedlich, und natürlich werden auch ihre Eigenschaften unterschiedlich sein. Daher ist es notwendig, die geeignete Reinigungsmethode für das Enzym auszuwählen. β2D2 Glukose-Dehydrogenase in Schweineleber ist ein multifunktionales Enzym, das mit TritorX2114 aus dem endoplasmatischen Retikulum isoliert werden kann, und NAD⁺ wird verwendet, um das an NADP⁺ gebundene Enzym auf der Agarose-Gel-Säule zu reinigen.

Anwendungen

Eines der Anwendungsgebiete von GDH ist die Regeneration von NADH. Es gibt einige Beispiele in der Literatur. GDH der Gattung Bacillus bei der Synthese und Umwandlung von 2-Keto-6-hydroxyhexansäure zu L-6-Hydroxynorleucin durch reduktive Aminierung unter Verwendung von Rinderleber-Glutamat-Dehydrogenase. Regeneriere NADH. Der gleiche Zweck wird für GDH von Bacillus verwendet. Die L-Carnitin-Dehydrogenase von Pseudomonas putida IAM12014 produziert L-Carnitin aus drei Dehydrocarnitinen. Eine weitere Anwendung von GDH ist die Regeneration von NADPH. Um 4-Chloro-3-oxobuttersäureethylester asymmetrisch zu reduzieren, wurde die Aldehydreduktase von S. salmonella mit GDH von Bacillus megaterium gekoppelt und als NADPH-Regenerator co-exprimiert. Gluconobacter sclerotiorum KY3613 von GDH wird für die Cofaktor-Rückgewinnung bei der Produktion von L-Folat verwendet. 6-Phosphat-Glukose-Dehydrogenase kann ebenfalls NADPH regenerieren. Kommerziell erhältliche Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase und die Regeneration von Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase aus Leptobacterium enteritidis wurden verwendet. Wir führten die stereoselektive Produktion von Glukose-Dehydrogenase von Bacillus subtilis und NADP⁺-abhängiger (R)-spezifischer Alkohol-Dehydrogenase (in E. coli überexprimiert) durch. Da E. coli-Zellen nicht über ausreichende Cofaktor-Regenerationssysteme verfügen, haben wir ein Co-Expressionssystem entwickelt, um zwei Gene in E. coli zu exprimieren und eine Ganzzell-Biotransformation durchzuführen.

Referenz