GMP-Kinase

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Einführung

Der Stoffwechsel ist in Krebszellen verändert, was zu einer Tumorproliferation führt. Eine Folge dieser metabolischen Veränderung sind erhöhte Spiegel der Nukleotide GTP und dGTP aufgrund der Hochregulierung der Nukleotidbiosynthese. GTP und dGTP sind Vorläufer von RNA bzw. DNA, und GTP ist eine wichtige Energiequelle für die Proteinbiosynthese sowie ein Schlüssel-Signalstoff über GTP-bindende Proteine. Ein unverzichtbares Enzym im Metabolismus von GTP und dGTP ist die humane Guanylatkinase (hGMPK, Genname GUK1, ATP: GMP Phosphotransferase, EC 2.7.4.8). Dieses Enzym existiert an der Schnittstelle der Salvage- und de novo Purin-Nukleotidbiosynthesewege. hGMPK katalysiert die reversible Phosphorylierung von GMP zu GDP unter Verwendung von ATP als Phosphorylgruppen-Donor. Daher ist hGMPK für die gesamte GDP/GTP-Produktion erforderlich, und chemotherapeutische Strategien, die darauf abzielen, GDP/GTP aus Krebszellen zu entfernen, haben zwei Enzyme der de novo Purin-Nukleotidbiosynthesewege, stromaufwärts von hGMPK, IMP-Dehydrogenase (IMPDH) und Guanosinmonophosphat-Synthase (GMPS), ins Visier genommen.

Die Depletion der GDP/GTP-Spiegel, die durch die Hemmung von IMPDH verursacht wird, kann durch die Zugabe von Guanosin oder Guanin zu den Zellen ergänzt werden, da der Salvage-Weg weiterhin durch die Wirkung von hGMPK und Nukleosid-Diphosphat-Kinasen funktioniert. Um die GDP/GTP-Produktion vollständig zu hemmen, müssen Enzyme, die stromabwärts der Schnittstelle der Salvage- und de novo Wege liegen, effektiv angegriffen werden. Daher könnte die Hemmung von hGMPK ein potenzielles therapeutisches Ziel sein. Derzeit wird hGMPK verwendet, um eine Vielzahl von antiviralen und antineoplastischen Nukleosid-Prodrugs zu aktivieren, unter denen 6-Thioguanin und sein eng verwandtes Analogon 6-Mercaptopurin sowie 9-β-d-Arabinofuranosylguanine die effektivsten sind. Kürzlich präsentierte eine Studie zur kleinen Winkel-Röntgenstreuung (SAXS) über hGMPK die ersten berichteten strukturellen Daten für hGMPK und zeigte, dass die Ligandenbindung zu einer Kompression von hGMPK um etwa 2 Å führt. Anschließend löste die Lösung-NMR-Spektroskopie die erste hochauflösende Struktur von hGMPK, die auch die erste Struktur mit atomarer Auflösung eines nukleotidfreien Säugetier-GMPK ist.

Abbildung 1. Zusammenfassung der Rolle von hGMPK in der Zelle (Khan, N.; et al. 2019)

Lösungsstruktur von hGMPK

Die Verteilung der elektrostatischen Ladung von hGMPK deutet darauf hin, dass die Nukleotidbindung durch elektrostatische Wechselwirkungen vermittelt wird.  Das stark positive Areal, das sich zwischen der LID-Domäne und der P-Schleife der CORE-Domäne befindet, umfasst Reste, die in der Röntgenstruktur von mGMPK gezeigt wurden, um ATP zu koordinieren. Reste, die mit Phosphatgruppen und den Guaninbasen interagieren, sind jeweils in positiven (GMP-BD) und negativen Bereichen (GMP-BD und CORE) vorhanden. Tatsächlich ist die Orientierung der Seitenketten, die an der Koordination von GMP und ATP beteiligt sind, zwischen Menschen und Mäusen sehr ähnlich, was die Bedeutung dieser elektrostatischen Bereiche für die Funktion von hGMPK demonstriert.

Abbildung 2. Verteilung der elektrostatischen Ladung der hGMPK-Oberfläche (Khan, N.; et al. 2019)

Als Nächstes verglichen wir die Domänenorientierung der hGMPK-NMR-Struktur mit den yGMPK- und mGMPK-Röntgenstrukturen, indem wir eine multiple Sequenzanpassung verwendeten, um die gleichen Reste aus jeder Spezies auszuwählen. Bemerkenswerterweise teilen sich hGMPK und mGMPK 88% Sequenzidentität, was insgesamt 24 von 197 unterschiedlichen Resten entspricht; jedoch bleibt die Orientierung der verschiedenen Seitenketten relativ ähnlich. Mit Ausnahme der N- und C-Termini befinden sich die strukturellen Unterschiede, die mit der Substitution dieser Reste verbunden sind, hauptsächlich um die Scharnierregionen, nämlich G30S, V86E und Q89R. Eine interessante Ausnahme ist L25F, das sich im α1-Zentrum befindet, wo die Leucin-Seitenkette von der Innenseite von hGMPK wegzeigt, während die Phenylalanin-Seitenkette in mGMPK nach innen zeigt. Wie bei vielen anderen Enzymen sind großflächige Domänenbewegungen erforderlich, damit hGMPK funktioniert. Die katalytische Effizienz wurde erheblich reduziert, entweder durch mechanischen Stress oder durch Mutation von Ser-35 oder Ser-37 zu Prolin.

Abbildung 3. Standort der CORE-Domäne, nsSNVs und aktiven Stellenreste, die im niedrigsten Energie-Konformer von apo-hGMPK dargestellt sind (Khan, N.; et al. 2019)