GMP‑Kinase

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Einleitung

Der Stoffwechsel ist in Krebszellen verändert, was zur Tumorproliferation führt. Eine Folge dieser metabolischen Veränderung sind erhöhte Spiegel der Nukleotide GTP und dGTP infolge der Hochregulation der Nukleotidbiosynthese. GTP bzw. dGTP sind Vorstufen von RNA bzw. DNA; zudem ist GTP eine wichtige Energiequelle für die Proteinbiosynthese und ein zentrales Signalmolekül über GTP-bindende Proteine. Ein unverzichtbares Enzym im Metabolismus von GTP und dGTP ist die humane Guanylatkinase (hGMPK, Genname GUK1, ATP:GMP-Phosphotransferase, EC 2.7.4.8). Dieses Enzym befindet sich an der Schnittstelle zwischen Salvage- und de novo-Biosynthesewegen der Purinnukleotide. hGMPK katalysiert die reversible Phosphorylierung von GMP zu GDP unter Verwendung von ATP als Phosphorylgruppendonor. Damit ist hGMPK für die gesamte GDP/GTP-Produktion erforderlich, und chemotherapeutische Strategien, die auf eine Depletion von GDP/GTP in Krebszellen abzielen, haben zwei Enzyme des de novo-Purinnukleotidbiosynthesewegs stromaufwärts von hGMPK adressiert: die IMP-Dehydrogenase (IMPDH) und die Guanosinmonophosphat-Synthase (GMPS).

Die durch Hemmung von IMPDH verursachte Absenkung der GDP/GTP-Spiegel kann durch Zugabe von Guanosin oder Guanin zu Zellen kompensiert werden, da der Salvage-Weg über die Wirkung von hGMPK und Nukleosiddiphosphat-Kinasen weiterhin funktioniert. Um die GDP/GTP-Produktion vollständig zu inhibieren, müssen daher Enzyme stromabwärts der Schnittstelle von Salvage- und de novo-Weg wirksam adressiert werden. Folglich könnte die Inhibition von hGMPK ein potenzielles therapeutisches Target darstellen. Derzeit wird hGMPK zur Aktivierung einer Vielzahl antiviraler und antineoplastischer Nukleosid-Prodrugs genutzt, von denen 6-Thioguanin sowie das eng verwandte Analogon 6-Mercaptopurin und 9-β-d-Arabinofuranosylguanin am wirksamsten sind. Kürzlich lieferte eine Studie mittels Kleinwinkel-Röntgenstreuung (SAXS) an hGMPK die ersten berichteten Strukturdaten für hGMPK und zeigte, dass die Ligandenbindung zu einer Kompression von hGMPK um etwa 2 Å führt. Anschließend wurde mittels Lösungs-NMR-Spektroskopie die erste hochauflösende Struktur von hGMPK bestimmt, die zugleich die erste Struktur eines nukleotidfreien, Säuger-GMPK mit atomarer Auflösung darstellt.

Abbildung 1. Zusammenfassung der Rolle von hGMPK in der Zelle (Khan, N.; et al. 2019)

Lösungsstruktur von hGMPK

Die Verteilung der elektrostatischen Ladungen von hGMPK legt nahe, dass die Nukleotidbindung durch elektrostatische Wechselwirkungen vermittelt wird. Der stark positiv geladene Bereich zwischen der LID-Domäne und der P-Loop der CORE-Domäne umfasst Reste, die in der Röntgenstruktur von mGMPK als an der Koordination von ATP beteiligt beschrieben wurden. Reste, die mit Phosphatgruppen bzw. den Guaninbasen interagieren, finden sich in positiven (GMP-BD) und negativen Bereichen (GMP-BD und CORE). Tatsächlich ist die Orientierung der Seitenketten, die an der Koordination von GMP und ATP beteiligt sind, zwischen Mensch und Maus sehr ähnlich, was die Bedeutung dieser elektrostatischen Bereiche für die Funktion von hGMPK unterstreicht.

Abbildung 2. Elektrostatische Ladungsverteilung der hGMPK-Oberfläche (Khan, N.; et al. 2019)

Als Nächstes verglichen wir die Domänenorientierung der hGMPK-NMR-Struktur mit den Röntgenstrukturen von yGMPK und mGMPK, wobei mittels multipler Sequenzalignment dieselben Reste aus jeder Spezies ausgewählt wurden. Bemerkenswert ist, dass hGMPK und mGMPK eine Sequenzidentität von 88 % aufweisen, was insgesamt 24 von 197 unterschiedlichen Resten entspricht; die Orientierung der unterschiedlichen Seitenketten bleibt jedoch relativ ähnlich. Mit Ausnahme der N- und C-Termini liegen die strukturellen Unterschiede, die mit der Substitution dieser Reste assoziiert sind, hauptsächlich um die Scharnierregionen, nämlich G30S, V86E und Q89R. Eine interessante Ausnahme ist L25F, lokalisiert im Zentrum von α1, wobei die Leucin-Seitenkette von der Innenseite von hGMPK wegzeigt, während die Phenylalanin-Seitenkette in mGMPK nach innen gerichtet ist. Wie bei vielen anderen Enzymen sind großskalige Domänenbewegungen für die Funktion von hGMPK erforderlich. Die katalytische Effizienz war signifikant reduziert, entweder durch mechanische Belastung oder durch Mutation von Ser-35 oder Ser-37 zu Prolin.

Abbildung 3. Lage der CORE-Domäne, nsSNVs und Reste des aktiven Zentrums im Konformer mit der niedrigsten Energie von apo-hGMPK (Khan, N.; et al. 2019)