IDUA

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Hintergrund

Asparagin-gebundene Protein-Glykosylierung ist eine der wichtigsten posttranslationalen Modifikationen in Eukaryoten, was dazu führt, dass die Oligosaccharidkette an das Nδ-Atom von Asparagin (Asn-Xaa-Ser/Thr, Xaa kann jede Aminosäure außer Prolin sein) gebunden wird. N-Glykosylierung ist sehr wichtig für Organismen, da sie eine Vielzahl von Fähigkeiten an Proteine verleiht, einschließlich immunologischer Erkennung, Zell-Signaltransduktion, Ligand-Rezeptor-Bindung, Faltung und Stabilität. Bei einigen lysosomalen Enzymen, wie α-Galaktosidase A und Glukozerebrosidase, kann Deglykosylierung die Stabilität des Proteins verringern, was wiederum die Enzymaktivität reduziert. Es fehlt jedoch noch an Forschungsdaten über die genaue Beziehung zwischen N-Glykan und Enzymaktivität.

α-L-Iduronidase (IDUA; EC 3.2.1.76) ist ein wichtiges lysosomales Enzym. Der Rückgang oder Verlust der IDUA-Aktivität führt zur Ansammlung von Glykosaminoglykanen in Lysosomen, was wiederum zu Mukopolysaccharidose Typ I (MPS I) führt. Die menschliche IDUA wird in 653 Aminosäuren übersetzt und hat N-Glykosylierung an sechs potenziellen Stellen (N110, N190, N336, N372, N415 und N451). Anschließend werden die 26 Reste am N-Terminus entfernt und in die reife Form im Lysosom verarbeitet.

IDUA hydrolysiert die glykosidische Bindung zwischen dem Ende der L-Iduronsäure (IdoA) und dem zweiten Zucker von N-Acetylgalaktosamin (GalNAc)-4-sulfat/N-sulfo-D-Glucosamin (GlcNS)-6-sulfat. Daher können IDUA-Defekte zur Ansammlung von Dermatan/Heparansulfat führen und zu systemischen Störungen, MPS I, einschließlich fortschreitender geistiger Behinderung, Kleinwuchs, vergrößertem und deformiertem Schädel, Hornhauttrübung, Gelenkkontrakturen und Hepatosplenomegalie, usw. Von 1981 bis 2003 betrug die Prävalenz von MPS I in England und Wales 1,07 pro 100.000 Geburten. Derzeit wird die Verwendung von chinesischen Hamster-Ovarien (CHO)-Zellen zur Expression von rekombinanter menschlicher IDUA (hIDUA) zur Entwicklung von Enzymersatztherapien genutzt, die weit verbreitet in der Behandlung von MPS I eingesetzt werden.

IDUA gehört zur Familie der Glykosid-Hydrolasen (GH) 39. Bisher wurde die Kristallstruktur der bakteriellen GH39 β-Xylosidase (XynB) erhalten. Darüber hinaus haben Studien das hIDUA-Homologiemodell berichtet, das aus Thermoanaerobacterium saccharolyticum XynB (PDB ID-Code 1PX8) konstruiert wurde, und die Kristallstruktur von apo-hIDUA, die in Pflanzensamen exprimiert wurde, wurde ebenfalls erhalten. Es fehlen jedoch noch strukturelle Daten von hIDUA, die in Säugetierzellen exprimiert werden, um ein tieferes Verständnis der Grundlagen von MPS I zu erlangen und neue Therapien zu entwickeln.

Abbildung 1. Reaktionsschema der Hydrolyse von Dermatansulfat, katalysiert durch Hidua (Maita, N.; et al. 2013)

Gesamtstruktur von hIDUA

Die Kristallstruktur von apo- und IdoA-hIDUA wurde erhalten, um die strukturelle Basis der Beziehung zwischen der hIDUA-Enzymaktivität und N-Glykane zu bestimmen. Es gibt zwei hIDUA-Untereinheiten in jeder asymmetrischen Einheit. hIDUA besteht aus drei Domänen: Die Reste 42-396 bilden eine (β/α)8-Triosephosphat-Isomerase (TIM)-Fassstruktur; die Reste 27-42 und 397-545 bilden eine β-Sandwich-Domäne mit einer kurzen Helix-Schleife-Helix (482-508), und die Reste 546-642 bilden eine Ig(Ig)-ähnliche Domäne. Die letzten beiden Domänen sind durch eine Disulfidbindung verbunden, die zwischen C541 und C577 liegt. Nach dem Vergleich ist die topologische Struktur des TIM-Fasses und der β-Sandwich-Domäne von hIDUA fast identisch mit der von XynB, jedoch ist die Aminosäurenlänge von XynB kürzer als die von hIDUA, und das C-terminal fehlt die Ig-ähnliche Domäne. Die Spitze des Mannose-Restes (Man7) erreicht die aktive Stelle und bildet einen Teil der Substratbindetasche. Eine hydrophobe Wechselwirkung zwischen Y355 und Man3 wurde ebenfalls beobachtet.

Abbildung 2. Domänenorganisation von hIDUA (Maita, N.; et al. 2013)

Neueste zwei Kristallstrukturen von hIDUA wurden in der Protein-Datenbank veröffentlicht, die Raumgruppen sind R3 (PDB ID-Code 4JXO) und P21 (PDB ID-Code 4JXP). Aber sie enthalten bis zu 6 Zucker und fehlen Man7, was möglicherweise auf die Verwendung des Pflanzensamen-Expressionssystems zurückzuführen ist. In der IdoA-gebundenen hIDUA-Struktur beobachten wir deutlich die Elektronendichte des Moleküls IdoA im Zentrum des TIM-Fasses. Der strukturelle Unterschied zwischen den apo- und IdoA-gebundenen Formen ist sehr gering; nur die Seitenkette von D187 dreht sich zur aktiven Stelle, eine Wasserstoffbrücke wird zwischen dem Oδ2-Atom und dem Rückgrat-Sauerstoff und Nδ-Atom von N181 gebildet. Diese Veränderung könnte ein enges Wasserstoffnetzwerk zwischen dem O2-Atom von IdoA und dem Nδ von N181 schaffen. In der Struktur von hIDUA, die durch IdoA gebunden ist, beobachten wir deutlich die Elektronendichte des IdoA-Moleküls, das sich im Zentrum des TIM-Fasses befindet. Nach dem Vergleich ist der strukturelle Unterschied zwischen den Bindungsformen von apo und IdoA sehr gering, nur die Seitenkette von D187 ist ein wenig zur aktiven Stelle gedreht, wodurch eine Wasserstoffbrücke gebildet wird. Diese Veränderung könnte ein enges Wasserstoffnetzwerk zwischen dem O2-Atom von IdoA und dem Nδ von N181 schaffen.

Abbildung 3. Molekulare Oberflächenrepräsentation um die Substratbindetasche von hIDUA (Untereinheit B) (Maita, N.; et al. 2013)