IDUA

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Hintergrund

Die Asparagin-gebundene Proteinglykosylierung ist eine der wichtigsten posttranslationalen Modifikationen in Eukaryoten; dabei wird die Oligosaccharidkette an das Nδ-Atom von Asparagin gebunden (Asn-Xaa-Ser/Thr, wobei Xaa jede Aminosäure außer Prolin sein kann). Die N‑Glykosylierung ist für Organismen von großer Bedeutung, da sie Proteinen vielfältige Eigenschaften verleiht, darunter Immunerkennung, zelluläre Signaltransduktion, Ligand‑Rezeptor‑Bindung, Faltung und Stabilität. Bei einigen lysosomalen Enzymen, wie α‑Galaktosidase A und Glukozerebrosidase, kann eine Deglykosylierung die Proteinstabilität verringern, was wiederum die Enzymaktivität reduziert. Es fehlen jedoch weiterhin Forschungsdaten zur exakten Beziehung zwischen N‑Glykanen und Enzymaktivität.

α‑L‑Iduronidase (IDUA; EC 3.2.1.76) ist ein wichtiges lysosomales Enzym. Eine Abnahme oder ein Verlust der IDUA‑Aktivität führt zur Akkumulation von Glykosaminoglykanen in Lysosomen und damit zur Mukopolysaccharidose Typ I (MPS I). Die humane IDUA wird als Protein mit 653 Aminosäuren translatiert und weist N‑Glykosylierungen an sechs potenziellen Stellen auf (N110, N190, N336, N372, N415 und N451). Anschließend werden 26 Reste am N‑Terminus entfernt und das Protein im Lysosom zur reifen Form prozessiert.

IDUA hydrolysiert die glykosidische Bindung zwischen dem terminalen L‑Iduronsäurerest (IdoA) und dem zweiten Zucker N‑Acetylgalaktosamin (GalNAc)‑4‑Sulfat bzw. N‑Sulfo‑D‑Glucosamin (GlcNS)‑6‑Sulfat. Daher können IDUA‑Defekte zur Akkumulation von Dermatan-/Heparansulfat führen und eine systemische Erkrankung, MPS I, verursachen, einschließlich progredienter geistiger Retardierung, Kleinwuchs, vergrößertem und deformiertem Schädel, Hornhauttrübung, Gelenkkontrakturen und Hepatosplenomegalie, etc. Von 1981 bis 2003 betrug die Prävalenz von MPS I in England und Wales 1,07 pro 100.000 Geburten. Derzeit wird die Expression rekombinanter humaner IDUA (hIDUA) in Zellen des chinesischen Hamsters (CHO) zur Entwicklung einer Enzymersatztherapie eingesetzt, die in der Behandlung von MPS I breit angewendet wird.

IDUA gehört zur Familie 39 der Glykosidhydrolasen (GH). Bislang wurde die Kristallstruktur der bakteriellen GH39‑β‑Xylosidase (XynB) bestimmt. Darüber hinaus wurden ein hIDUA‑Homologiemodell auf Basis von Thermoanaerobacterium saccharolyticum XynB (PDB‑ID 1PX8) sowie die Kristallstruktur von Apo‑hIDUA, exprimiert in Pflanzensamen, beschrieben. Strukturdaten von hIDUA, die in Säugerzellen exprimiert wurde, sind jedoch weiterhin erforderlich, um die molekulare Grundlage von MPS I besser zu verstehen und neue Therapien zu entwickeln.

Abbildung 1. Reaktionsschema der durch Hidua katalysierten Hydrolyse von Dermatansulfat (Maita, N.; et al. 2013)

Gesamtstruktur von hIDUA

Die Kristallstruktur von Apo‑hIDUA sowie von IdoA‑gebundenem hIDUA wurde bestimmt, um die strukturelle Grundlage der Beziehung zwischen der Enzymaktivität von hIDUA und N‑Glykanen zu klären. In jeder asymmetrischen Einheit befinden sich zwei hIDUA‑Untereinheiten. hIDUA besteht aus drei Domänen: Die Reste 42–396 bilden eine (β/α)8‑Triosephosphatisomerase (TIM)‑Barrel‑Faltung; die Reste 27–42 und 397–545 bilden eine β‑Sandwich‑Domäne mit einer kurzen Helix‑Loop‑Helix‑Struktur (482–508), und die Reste 546–642 bilden eine Ig(Ig)‑ähnliche Domäne. Die beiden letztgenannten Domänen sind über eine Disulfidbrücke zwischen C541 und C577 verbunden. Im Vergleich ist die topologische Struktur des TIM‑Barrels und der β‑Sandwich‑Domäne von hIDUA nahezu identisch mit der von XynB; XynB ist jedoch kürzer und weist am C‑Terminus keine Ig‑ähnliche Domäne auf. Die Spitze des Mannoserests (Man7) reicht bis in das aktive Zentrum und bildet einen Teil der Substratbindetasche. Zudem wurde eine hydrophobe Wechselwirkung zwischen Y355 und Man3 beobachtet.

Abbildung 2. Domänenorganisation von hIDUA (Maita, N.; et al. 2013)

Kürzlich wurden zwei Kristallstrukturen von hIDUA in der Protein Data Base veröffentlicht; die Raumgruppen sind R3 (PDB‑ID 4JXO) und P21 (PDB‑ID 4JXP). Diese enthalten jedoch nur bis zu 6 Zucker und es fehlt Man7, was möglicherweise auf das verwendete Expressionssystem in Pflanzensamen zurückzuführen ist. In der IdoA‑gebundenen hIDUA‑Struktur ist die Elektronendichte des IdoA‑Moleküls im Zentrum des TIM‑Barrels eindeutig erkennbar. Der strukturelle Unterschied zwischen der Apo‑ und der IdoA‑gebundenen Form ist sehr gering; lediglich die Seitenkette von D187 klappt in Richtung des aktiven Zentrums, wodurch eine Wasserstoffbrücke zwischen dem Oδ2‑Atom und dem Rückgrat‑Sauerstoff sowie dem Nδ‑Atom von N181 gebildet wird. Diese Änderung kann ein dichtes Wasserstoffbrückennetzwerk zwischen dem O2‑Atom von IdoA und dem Nδ von N181 erzeugen. In der Struktur von IdoA‑gebundenem hIDUA ist die Elektronendichte des IdoA‑Moleküls im Zentrum des TIM‑Barrels eindeutig zu erkennen. Nach Vergleich ist der strukturelle Unterschied zwischen den Bindungsformen von Apo und IdoA sehr gering; lediglich die Seitenkette von D187 ist geringfügig in Richtung des aktiven Zentrums verschwenkt und bildet dadurch eine Wasserstoffbrücke. Diese Änderung kann ein dichtes Wasserstoffbrückennetzwerk zwischen dem O2‑Atom von IdoA und dem Nδ von N181 erzeugen.

Abbildung 3. Darstellung der molekularen Oberfläche um die Substratbindetasche von hIDUA (Untereinheit B) (Maita, N.; et al. 2013)