Laccase

Laccase ist eine Polyphenoloxidase aus der Familie der „Blue Oxidases“ und zählt zu den wichtigen lignozellulolytischen Enzymen. Laccase wurde erstmals in Toxicodendron vernicifluum entdeckt. In der Folge wurde festgestellt, dass auch bestimmte Pilze Laccase sekretieren. Laccase kann den Abbau einer Vielzahl aromatischer Verbindungen, insbesondere von Phenolen, katalysieren und ist ein natürliches, umweltfreundliches Enzym. Die zielgerichtete Entwicklung laccasebasierter Verfahren zum Abbau von Holzfasern und bestimmten Polymerverbindungen kann den Einsatz von Chemikalien reduzieren, Produktionskosten senken und die Umwelt schützen.

Abbildung 1. Röntgenkristallographisch bestimmte Kristallstruktur von Laccase III. (C.F. Blanford. 2007)

Quellen

Laccase wurde 1883 von Yoshida erstmals in oxicodendron vernicifluum entdeckt. Später wurde festgestellt, dass bestimmte Pilze dieses Enzym ebenfalls sekretieren können. Diese Proteine weisen je nach Herkunft unterschiedliche Molekulargewichte auf, etwa 59–390 kD. Die von einigen Stämmen produzierte Laccase besteht aus mehreren Isoenzymen, die jeweils monomere Enzyme sind. Die Enzymmoleküle enthalten in der Regel 4 Kupferatome. Die geeignete Reaktionstemperatur von Laccase ist niedrig, die katalytische Effizienz ist in saurem Milieu relativ hoch, und es besteht Substratspezifität. Zu den wichtigsten laccase-sezernierenden Pilzen zählen Phanerochaete chrysosporium, Coriolus versicolor, Trametes versicolor, Pleurotus ostreatus sowie Shiitake, die sämtlich zu den Basidiomyceten gehören. Laccase spielt in Pflanzen eine wesentliche Rolle bei der Ligninsynthese, während die von Pilzen sekretierte Laccase genau gegenteilig wirkt und hauptsächlich dem Ligninabbau dient. Daher eröffnet der Ligninabbau durch pilzliche Laccase ein breites Anwendungsspektrum.

Molekularstruktur

Die Primärstruktur der Laccase besteht aus einer Greek-Key-β-Barrel-Topologie und umfasst etwa 500 Aminosäurereste in drei aufeinanderfolgenden Domänen. Diese Aminosäuren sind auf drei Domänen verteilt: die erste Domäne mit den initialen 150 Aminosäuren, die zweite Domäne mit 150–300 Aminosäuren und die dritte Domäne mit 300–500 Aminosäuren. Die Stabilisierung der Laccase-Struktur beruht auf dem Vorhandensein von Disulfidbrücken zwischen Domäne I und II sowie zwischen Domäne I und III.

Laccase ist dafür bekannt, pro Proteineinheit in vier unterschiedlichen katalytischen Cu-Formen vorzuliegen. Diese vier Cu-Ionen werden in drei Strukturtypen unterteilt:

Abbildung 2. Kupferzentren der Laccase: Typ 1, Typ 2 und Typ 3. (Agrawal K. et al. 2018)

Typ-1-Kupfer verleiht Multikupferproteinen die blaue Farbe, die auf eine intensive elektronische Absorption infolge der kovalenten Kupfer–Cystein-Bindung zurückzuführen ist. Typ-1-Kupfer weist eine trigonal koordinierte Geometrie auf, mit zwei Histidinen und einem Cystein als konservierten äquatorialen Liganden; eine Position ist üblicherweise variabel. Bei pilzlichen Laccasen ist der axiale Ligand Leucin oder Phenylalanin.

Die Typ-2- bzw. „normale“ Cu-Stelle ist durch das Fehlen ausgeprägter Absorptionsmerkmale im sichtbaren Bereich gekennzeichnet und zeigt typische Elektronenspinresonanz-(EPR-)Spektren. Typ-2-Kupfer wird durch zwei Histidinreste koordiniert und ist strategisch in unmittelbarer Nähe zum Typ-3-Kupfer positioniert.

Typ 3 ist ein binukleares Zentrum, das durch sechs Histidine reguliert wird und spektroskopisch durch eine Elektronenabsorption bei 330 nm (oxidierte Form) sowie das Fehlen eines EPR-Signals charakterisiert ist. Letzteres ist auf die starke antiferromagnetische Kopplung zwischen den beiden Typ-3-Kupferatomen zurückzuführen, die mit dem Vorhandensein einer Hydroxidbrücke zusammenhängt.

Nachweismethoden

Derzeit ist die gebräuchlichste Methode zum Nachweis von Laccase ein anschauliches Verfahren, bei dem durch die Reaktion von Laccase mit einer spezifischen Substanz innerhalb kurzer Zeit eine Farbänderung erzeugt wird, z. B. Titrationsmethoden und die Farbring-Reaktionsmethode auf PDA-Medium. So kann Laccase mit Substanzen wie Syringaldazin, Guajakol, α-Naphthol, Pyrogallussäure und Zitronensäure reagieren und rasch Produkte mit spezifischer Färbung bilden. Anhand der spezifischen Farbreaktion von Laccase mit diesen Substanzen wird bestimmt, ob ein Stamm Laccase produziert. Die Laccaseproduktion kann anhand der Farbtiefe und der Größe des innerhalb derselben Zeit gebildeten Farbrings abgeschätzt werden.

Fermentationsbedingungen

Kirk et al. ermittelten durch umfangreiche Untersuchungen die optimalen Bedingungen für die Laccaseproduktion im Rahmen der Pilzfermentation. Das in dieser Studie identifizierte Basismedium wird von Forschenden weithin verwendet. Die Studie zeigte, dass die Art der Stickstoffquelle im Laccase-Fermentationsprozess die Laccaseproduktion nicht signifikant beeinflusst, während die Stickstoffdosierung einer der Schlüsselfaktoren ist, die die Laccaseproduktion bestimmen. Eine stickstofflimitierte Kultur kann die Laccaseproduktion deutlich erhöhen. Laccase ist eine kupferhaltige Polyphenoloxidase; daher ist Cu²⁺ für Synthese und Aktivität der Laccase essenziell. Niedermolekulare aromatische Verbindungen, die strukturell Lignin oder Ligninabbaufragmenten ähneln, können die Laccaseproduktion ebenfalls induzieren und signifikant steigern, z. B. Guajakol, Benzylalkohol, Resveratrol, Vanillinsäure, Tween usw. Auch eine Begrenzung des Kohlenstoffgehalts kann die Laccaseproduktion deutlich erhöhen. Galliano et al. verglichen Fest- und Flüssigmedium. Der Ligninabbau im Festmedium war mittels 14C-Radiomarkierung signifikant höher als im Flüssigmedium, und die produzierte Laccasemenge war 15-fach höher.

Anwendung

Abbildung 3. Anwendungen von Laccase in verschiedenen industriellen und biotechnologischen Sektoren. (Agrawal K. et al. 2018)

Beim Aufschlussprozess wird die pflanzliche Cellulose vom Lignin getrennt, was die Entfernung von Lignin aus dem Zellstoff erforderlich macht. Biopulping stützt sich hauptsächlich auf verschiedene Enzyme, die durch mikrobielle Fermentation gebildet werden, um Lignin zu entfernen und dadurch den Einsatz chemischer Agenzien zu reduzieren, die Umwelt zu schützen und Produktionskosten zu senken. Laccase kann Lignin selektiv abbauen und die Nachteile des mechanischen Aufschlussverfahrens vermeiden, sodass die Produktion unter milden Bedingungen bei Normaltemperatur und Normaldruck erfolgen kann. Dadurch lassen sich Anlagen- und Energieaufwand reduzieren, der Zellstoffproduktionszyklus verkürzen und die Produktionskosten senken.

Grüne Pflanzen machen mehr als 95 % der terrestrischen Biomasse aus. Die rationale Nutzung grüner Pflanzen ist ein wirksamer Ansatz zur Lösung von Energieproblemen. Das Verhältnis von Lignin, Cellulose und Hemicellulose zur pflanzlichen Trockenmasse beträgt jeweils 20 %, 45 % bzw. 20 %. Dabei ist der Abbau und die Verwertung von Lignin am schwierigsten. Das zentrale Problem, das für eine vollständige Degradation und Nutzung dieser Biomasseressourcen gelöst werden muss, ist der Ligninabbau. Durch den Einsatz von Laccase kann Lignin in kleine Moleküle zerlegt und anschließend einer Biofermentation zugeführt werden, wodurch neue Energiequellen wie Bioalkohol entstehen.

Laccase wird auch in der Lebensmittelindustrie breit eingesetzt. Eine wesentliche Anwendung ist die Erhöhung der Stabilität von Glukose. Die Zugabe von Laccase kann die Stabilität von Wein verbessern und dadurch die eingesetzte Menge an Schwefeldioxid reduzieren. Darüber hinaus kann Laccase auch bei der Fruchtsaftherstellung eine sehr gute Rolle spielen, da eine übermäßige Oxidation von Phenolen die Produktqualität beeinträchtigt und Laccase phenolische Substanzen wie Catechol im Saft entfernen kann. Dadurch kann der Fruchtsaft ohne zusätzlichen Klärungsstoff stabil geklärt werden.

Literatur