Laccase

Laccase ist eine Polyphenoloxidase, die zur Familie der blauen Oxidasen gehört und eines der wichtigen lignocellulolytischen Enzyme ist. Laccase wurde erstmals im toxicodendron vernicifluum entdeckt. Später wurde festgestellt, dass bestimmte Pilze ebenfalls Laccase sekretieren. Laccase kann den Abbau einer Vielzahl von aromatischen Verbindungen, insbesondere Phenolen, katalysieren und ist ein natürliches, umweltfreundliches Enzym. Die rationale Entwicklung des Abbaus von Holzfasern und einigen Polymerverbindungen durch Laccase kann den Einsatz von Chemikalien reduzieren, die Produktionskosten senken und die Umwelt schützen.

Abbildung 1. Röntgenbestimmte Kristallstruktur von Laccase III. (C.F. Blanford. 2007)

Quellen

Laccase wurde erstmals 1883 von Yoshida im oxicodendron vernicifluum entdeckt. Später wurde entdeckt, dass bestimmte Pilze dieses Enzym ebenfalls sekretieren können. Diese Proteine haben je nach Quelle unterschiedliche Molekulargewichte, etwa 59-390 kD. Die von einigen Stämmen produzierte Laccase besteht aus mehreren Isoenzymen, die beide monomere Enzyme sind. Die Enzymmoleküle enthalten im Allgemeinen 4 Kupferatome. Die geeignete Reaktionstemperatur von Laccase ist niedrig, die katalytische Effizienz in saurer Umgebung ist relativ hoch, und die Substratspezifität wird erreicht. Die Hauptpilze, die Laccase sekretieren, sind Phanerochaete chrysosporium, Coriolus versicolor, Trametes versicolor, Pleurotus ostreatus und Shiitake, die alle zu den Basidiomyceten gehören. Laccase spielt eine wichtige Rolle bei der Synthese von Lignin in Pflanzen, während die von Pilzen sekretierte Laccase genau das Gegenteil bewirkt, nämlich den Abbau von Lignin. Daher macht der Abbau von Lignin durch pilzliche Laccase eine breite Anwendung möglich.

Molekulare Struktur

Die primäre Struktur von Laccase besteht aus einer griechischen Schlüssel-Beta-Fass-Topologie, die aus etwa 500 Aminosäureresten in drei aufeinanderfolgenden Domänen besteht. Diese Aminosäuren sind in drei Domänen verteilt: erste Domäne mit 150 anfänglichen Aminosäuren, zweite Domäne mit 150 und 300 Aminosäuren und dritte Domäne mit 300–500 Aminosäuren. Die Stabilisierung der Laccase-Struktur erfolgt durch die Anwesenheit von Disulfidbrücken zwischen den Domänen I und II sowie zwischen den Domänen I und III.

Laccase ist bekannt dafür, in vier verschiedenen Cu-katalytischen Formen pro Proteineinheit zu existieren. Diese vier Cu-Ionen sind in drei Strukturtypen unterteilt:

Abbildung 2. Kupferzentren der Laccase: Typ 1, Typ 2 und Typ 3. (Agrawal K. et al. 2018)

Typ 1 Kupfer verleiht den Multikupferproteinen eine blaue Farbe, was auf die intensive elektronische Absorption zurückzuführen ist, die durch die kovalente Kupfer-Cystein-Bindung verursacht wird. Typ 1 Kupfer hat eine trigonal koordinierte Struktur, mit zwei Histidinen und einer Cystein als konservierte äquatoriale Liganden und einer Position, die normalerweise variabel ist, und im Fall von pilzlichen Laccasen ist der axiale Ligand Leucin oder Phenylalanin.

Typ 2 oder normale Cu-Stelle ist durch das Fehlen starker Absorptionsmerkmale im sichtbaren Bereich gekennzeichnet und zeigt übliche Elektronenspinresonanz (EPR)-Spektren. Typ 2 Kupfer wird von zwei Histidinresten koordiniert und ist strategisch nahe bei Typ 3 Kupfer positioniert.

Typ 3 ist ein binukleares Zentrum, das durch sechs Histidine reguliert wird und spektroskopisch durch eine Elektronenabsorption bei 330 nm (oxidierte Form) und das Fehlen eines EPR-Signals aufgrund der starken antiferromagnetischen Kopplung zwischen den beiden Typ 3 Kupferatomen charakterisiert ist, die mit der Anwesenheit einer Hydroxylbrücke zusammenhängt.

Nachweismethoden

Derzeit ist die gängigste Methode zur Detektion von Laccase eine intuitive Methode zur Erzeugung eines Farbwechsels in kurzer Reaktionszeit durch Verwendung von Laccase und einer spezifischen Substanz, wie z.B. Titrationsmethode und Farbwechselkreisreaktionsmethode, die mit einem PDA-Medium verwendet wird. Zum Beispiel kann Laccase mit Substanzen wie Syringaldazin, Guaiacol, α-Naphthol, Pyrogallol und Zitronensäure reagieren und schnell Substanzen einer spezifischen Farbe erzeugen. Anhand der spezifischen Farbwechselreaktion von Laccase und diesen Substanzen wird bestimmt, ob der Stamm Laccase produziert. Die Laccase-Produktion kann basierend auf der Farbtiefe und der Größe des in der gleichen Zeit erzeugten Farbkreises geschätzt werden.

Fermentationsbedingungen

Kirk et al. haben die besten Bedingungen für die Laccase-Produktion im Pilzfermentationsprozess durch umfangreiche Forschung ermittelt. Das in dieser Studie identifizierte Grundmedium wurde von Forschern weit verbreitet verwendet. Die Studie ergab, dass die Art der Stickstoffquelle im Laccase-Fermentationsprozess die Laccase-Produktion nicht signifikant beeinflussen kann und die Stickstoffdosierung einer der Schlüsselfaktoren ist, die die Laccase-Produktion beeinflussen. Eine stickstofflimitierte Kultur kann die Laccase-Produktion erheblich steigern. Laccase ist eine kupferhaltige Polyphenoloxidase, daher ist Cu²⁺ für die Synthese und Aktivität von Laccase unerlässlich. Niedermolekulare aromatische Verbindungen, die in ihrer Struktur Lignin oder Lignin-abgebaute Fragmente ähneln, können ebenfalls die Laccase-Produktion induzieren und erheblich steigern, wie z.B. Guaiacol, Benzylalkohol, Resveratrol, Vanillinsäure, Tween usw. Eine Begrenzung des Kohlenstoffgehalts kann ebenfalls die Produktion von Laccase erheblich steigern. Die französischen Galliano et al. verglichen das feste und flüssige Medium. Der Ligninabbau im festen Medium war durch die 14C-Radiolabeling-Methode signifikant höher als im flüssigen Medium, und die Menge an produzierter Laccase war 15-mal höher.

Anwendung

Abbildung 3. Anwendungen von Laccase in verschiedenen industriellen und biotechnologischen Sektoren. (Agrawal K. et al. 2018)

Der Zellstoffprozess trennt die Pflanzenzellulose vom Lignin, was die Entfernung von Lignin aus dem Zellstoff erforderlich macht. Biopulping beruht hauptsächlich auf verschiedenen Enzymen, die durch mikrobielle Fermentation produziert werden, um Lignin zu entfernen, wodurch der Einsatz von chemischen Mitteln reduziert, der Umweltschutz gefördert und die Produktionskosten gesenkt werden. Laccase kann Lignin selektiv abbauen und die Nachteile des mechanischen Zellstoffprozesses beseitigen, sodass die Produktion unter milden Bedingungen bei Normaltemperatur und Normaldruck durchgeführt werden kann, und kann Ausrüstung und Energieverbrauch sparen, den Zellstoffproduktionszyklus verkürzen und die Produktionskosten senken.

Grüne Pflanzen machen mehr als 95 % der terrestrischen Biomasse aus. Die rationale Nutzung von grünen Pflanzen ist ein effektiver Weg zur Lösung von Energieproblemen. Das Verhältnis von Lignin, Cellulose und Hemicellulose in Pflanzen zum Trockengewicht der Pflanzen beträgt 20 %, 45 % und 20 %. Unter ihnen ist der Abbau und die Nutzung von Lignin am schwierigsten. Das erste Problem, das gelöst werden muss, um diese Biomasseressourcen vollständig abzubauen und zu nutzen, ist der Abbau von Lignin. Die Verwendung von Laccase zur Zersetzung von Lignin in kleine Moleküle für die Biofermentation führt zu neuen Energiequellen wie Bioalkohol.

Laccase wurde auch in der Lebensmittelindustrie weit verbreitet eingesetzt. Die Erhöhung der Stabilität von Glukose ist eine wichtige Anwendung von Laccase in der Lebensmittelindustrie. Die Zugabe von Laccase kann die Stabilität des Weins verbessern und somit die Menge an verwendeten Schwefeldioxid reduzieren. Darüber hinaus kann Laccase auch eine sehr gute Rolle in der Fruchtsaftproduktion spielen, da die übermäßige Oxidation von Phenolen die Qualität des Produkts beeinträchtigt, und Laccase kann phenolische Substanzen wie Catechol im Saft entfernen. Daher kann der Fruchtsaft stabil geklärt werden, ohne zusätzliche Klärmittel.

Referenzen