LDH

Lactatdehydrogenase (LDH, EC 1.1.1.27), auch bekannt als NAD⁺ Oxidase, katalysiert die reversible Umwandlung von Pyruvat und L-Milchsäure und ist ein wichtiges Oxidoreduktase-Enzym im Prozess der Glykolyse, das weit verbreitet in tierischen Geweben und verschiedenen mikrobiellen Zellen vorkommt. Die Milchsäure ist ein chirales Molekül mit zwei Konfigurationen von D-Milchsäure und L-Milchsäure. Der menschliche Körper kann nur L-Milchsäure metabolisch verarbeiten und nutzen. Daher hat die Weltgesundheitsorganisation die Verwendung von L-Milchsäure als Lebensmittelzusatzstoff und Arzneimittel empfohlen, um die derzeit weit verbreitete DL-Milchsäure zu ersetzen. Darüber hinaus werden L-Milchsäure, L-Lactat und deren Polymere auch in der Medizin, Landwirtschaft und chemischen Industrie weit verwendet. Menschen nutzen auch Poly-L-Milchsäure zur Herstellung von biologisch abbaubaren Kunststoffen, grünen Verpackungsmaterialien und Haushaltsfolien, um die zunehmend ernsthaften Umweltverschmutzungsprobleme zu lösen.

Quellen

Lactatdehydrogenase ist weit verbreitet in tierischen Geweben wie Myokard, Leber, Niere, Skelettmuskulatur, Bauchspeicheldrüse und Lunge. Tierische LDH ist ein tetrameres Molekül mit einem Molekulargewicht von 130000 bis 145000. Es gehört zur Isozymfamilie und hat fünf molekulare Formen. Zwei der Formen bestehen aus denselben Untereinheiten. Diese beiden LDHs sind H₄, die hauptsächlich im Myokard verteilt sind, und M₄, die hauptsächlich in der Skelettmuskulatur verteilt sind. Die anderen drei LDH bestehen aus gemischten Untereinheiten, sie sind H₃M, H₂M₂ und HM₃. In jeder Form von LDH enthält jede H- oder M-Untereinheit ein aktives katalytisches Zentrum. Bei Tetrameren mit gemischten Untereinheiten, wie H₃M, sind die katalytischen kinetischen Eigenschaften die gleichen wie die 3:1-Mischung von H₄ und M₄, was darauf hinweist, dass die aktiven Zentren der gleichen Untereinheiten in den verschiedenen Typen von LDH-Molekülen sehr ähnlich sind und es keine signifikante Wechselwirkung zwischen den katalytischen Reaktionen auf jeder Untereinheit gibt.

Bakterielle Lactatdehydrogenase kann in zwei Typen unterteilt werden: der eine ist LDH mit NAD⁺ als Coenzym (NAD-abhängige LDH, nLDH), und der andere ist LDH mit Cytochrom c, FAD oder FMN, die zur NAD⁺-unabhängigen Art gehört (NAD-unabhängige LDH, iLDH). iLDH ist sowohl in anaeroben als auch in aeroben Bakterien vorhanden, die Milchsäure katalysieren, um Pyruvat zu produzieren, was kein NAD⁺/NADH als Coenzym erfordert. Keine in vivo und in vitro Experimente haben nachgewiesen, dass das Enzym die Umkehrreaktion katalysieren kann. nLDH befindet sich im Zytoplasma und ist das Schlüsselenzym im Produktionsprozess des Embden–Meyerhof–Parnas (EMP-Weg). Es wird hauptsächlich verwendet, um Pyruvat zu Milchsäure zu katalysieren. Die Aktivität von nLDH wird durch die Sauerstoffversorgung der Bakterien beeinflusst. Bestimmte Bakterien-nLDH binden unter alkalischen Bedingungen an Milchsäure und NAD. In mikrobiellen Zellen wurden keine Isoenzyme von LDH gefunden, und ihre Erhaltung war weit unter der von tierischen Geweben. Die LDH-Eigenschaften verschiedener Stämme waren ziemlich unterschiedlich.

Katalytischer Mechanismus

L-Lactatdehydrogenase katalysiert reversibel die Oxidation von L-Lactat zur Produktion von Pyruvat, wobei NAD⁺/NADH als Coenzym verwendet wird. In dieser Reaktion bindet jede Untereinheit von LDH ein Substratmolekül und ein Coenzym-Molekül und reagiert unabhängig. In der positiven Reaktion katalysiert LDH mit Hilfe von NAD⁺ reversibel die Oxidation von deprotonierter Milchsäure zur Produktion von deprotonierter Pyruvat und H⁺. Gleichzeitig bindet NAD⁺ ein H⁺ vom Substrat, um NADH zu bilden. Die Reaktion kann umgekehrt werden. Die Reaktionsgleichung lautet: Pyruvat + reduziertes Coenzym I + H⁺ → Milchsäure + NAD⁺. E. Silverstein et al. zeigten, dass der katalytische Mechanismus der LDH-Katalysereaktionen wie folgt ist: Zuerst bindet die Protease an das Coenzym (NADH) als binärer Komplex. Gleichzeitig ändert sich die Konformation des Enzyms, das an das Substrat Pyruvat bindet. Während der Reaktion wird das Produkt Milchsäure freigesetzt, dann wird das Enzym von dem oxidierten Coenzym (NAD⁺) getrennt. Das H⁺, das in der Reaktion erzeugt wird, wird an den Enzymrückstand (His-195) übertragen und nach Abschluss der Reaktion freigesetzt.

Anwendungen

LDH hat einen wichtigen Wert, wenn es zur Analyse anderer Enzyme und biologischer Produkte verwendet wird. LDH ist ein universelles Enzym, das andere Enzyme wie Alanin-Aminotransferase (ALT), ATPase, Myokinase und Pyruvatkinase nachweist. ALT ist ein häufig verwendetes klinisches Diagnostikenzym. Wenn im Gewebe eine Schädigung auftritt, wird eine große Menge ALT aus der Zelle in das Blut freigesetzt, was die Aktivität von ALT im Serum erhöht. Das Prinzip der Reaktion zur Bestimmung der ALT-Aktivität durch LDH ist: L-Alanin + α-Ketoglutarat → Pyruvat + L-Glutaminsäure; Pyruvat + NADH + H⁺ → L-Milchsäure + NAD⁺ + H₂O. Die Reduktion von NADH führt zu einem Rückgang der Absorption bei einer Wellenlänge von 340 nm, was proportional zur ALT-Aktivität ist, wodurch festgestellt werden kann, ob das Gewebe erkrankt ist. Die Reinheit von LDH beeinflusst direkt die Genauigkeit der Bestimmung der ALT-Aktivität. Darüber hinaus spielt LDH auch eine sehr wichtige Rolle bei der Bestimmung von Triglyceriden.

Derzeit kann LDH auch in der Nanotechnologie verwendet werden. Durch die Immobilisierung von LDH auf der Oberfläche eines nanogold-cystamin-modifizierten Goldelektroden kann eine neuartige nano-biomimetische funktionale Schnittstelle konstruiert werden. Der neuartige Enzym-Biosensor, der auf dieser funktionalen Schnittstelle basiert, zeigt eine gute lineare Beziehung zur elektrokatalytischen Reaktion von Milchsäure und hat eine hohe Empfindlichkeit und Selektivität zur Bestimmung von Milchsäure, was gute Anwendungsaussichten in klinischen und biologischen Bereichen hat. Darüber hinaus wurde die Anwendung des LDH-Kits zur Bestimmung der NK-Zellaktivität ebenfalls angewendet. Diese Methode beseitigt die umständlichen Verfahren wie vorläufige Reagenzien und kann für automatische Analysatoren zur Messung von Batch-Standards verwendet werden.