L-Glutamat-Oxidase

L-Glutamat-Oxidase ist ein potenziell sehr nützliches Enzym für Tool-Anwendungen; als Coenzym dient Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD), ein Flavin-Cofaktor. Unter Verwendung von L-Glutaminsäure als Substrat wird diese mit hoher Substratspezifität zu Wasserstoffperoxid, Ammoniak und α-Ketoglutarat umgesetzt. L-Glutamat-Oxidase (GLOD) ist eine L-Aminosäure-Oxidase, die FAD als Coenzym nutzt; ohne Zugabe exogener Cofaktoren wird L-Glutaminsäure desaminiert und es entstehen α-Ketoglutarsäure, Ammoniak und Wasserstoffperoxid. L-Glutamat-Oxidase zeichnet sich durch hohe Spezifität und hohe Affinität zum Reaktionssubstrat, milde Reaktionsbedingungen sowie hohe katalytische Effizienz aus und wird breit in der Lebensmittelindustrie, der industriellen Fermentation und der pharmazeutischen Industrie eingesetzt. Seit ihrer Entdeckung in den 1980er-Jahren ist dieses Enzym national wie international ein Forschungsschwerpunkt und zählt zu den potenziellen Tool-Enzymen. Bis heute konzentrieren sich die Forschungsschwerpunkte zur L-Glutamat-Oxidase im In- und Ausland im Wesentlichen auf zwei Aspekte: Zum einen die Untersuchung von Enzymmechanismus und -struktur mithilfe aktueller Beobachtungs- und Messmethoden; zum anderen die fortlaufende Entwicklung hochproduzierender, aktiver Stämme und deren Charakterisierung. Ziel ist es, die Enzymeigenschaften für Anwendungen im Alltag und in industriellen Prozessen nutzbar zu machen.

Abbildung 1. Proteinstruktur der L-Glutamat-Oxidase.

Quellen der L-Glutaminsäure-Oxidase

L-Aminosäure-Oxidasen sind in zahlreichen Quellen vorhanden und können aus Schlangengift, vielen Tieren sowie Mikroorganismen isoliert werden. Mikroorganismen sind breit verfügbar, ihre Enzymproduktionskapazität ist jedoch häufig begrenzt. Im aktuellen Forschungsstand wird L-Glutaminsäure-Oxidase überwiegend aus Mikroorganismen isoliert. Dabei ist die Enzymproduktionsleistung von Streptomyces stärker als bei anderen Stämmen; die Enzymausbeute erreicht 6,4 U/ml. Die erste Beobachtung von L-Glutaminsäure-Oxidase erfolgte durch JURTSHUK und MEMANUS in Membranpräparationen von A. veneziarum, jedoch ohne Substratspezifität; die erste Bestätigung im eigentlichen Sinne erfolgte 1983 durch KAMEI T et al., die das Vorhandensein von L-Glutaminsäure-Oxidase in der Fermentationsbrühe von Streptomyces violascens nachwiesen. Die relative Molekülmasse beträgt etwa 60.000. Das Enzym zeigt ein für Flavinproteine charakteristisches Absorptionsspektrum und erfordert keine Beteiligung exogener Hilfsfaktoren; die Spezifität ist jedoch nicht ausgeprägt, da es auch auf L-Glutaminsäure, L-Glutamin und L-Histidin wirkt.

Anwendung bei der Bestimmung von Kreatinin

1993 entwickelten RUI C S und Kollegen unter Einsatz von L-Glutaminsäure-Oxidase ein Flussinjektionssystem zur Bestimmung des Kreatiningehalts im Blut. Es verwendet einen Zweikanal-Assay, um Einflüsse von endogenem Glutamat und Ammoniak im Blut auf die Messung zu vermeiden. Die erste Antwort entspricht der Gesamtantwort aus endogenem Ammoniak, Glutaminsäure und Kreatinin; die zweite Antwort entspricht der Antwort aus endogenem Ammoniak und Glutaminsäure. Die Messbereiche erreichen 2 mmol/L bzw. 3 mmol/L. Das System weist eine gute Stabilität und Reproduzierbarkeit auf und zeigt eine gute Korrelation mit den mittels chemischer Methoden ermittelten Kreatininwerten.

Anwendung in Biosensoren

L-Glutaminsäure hat ein breites Anwendungsspektrum in den Bereichen Medizin, Lebensmittelzusatzstoffe, Nahrungsergänzungsmittel usw.; die durchschnittliche tägliche Aufnahme pro Person überschreitet jedoch 6 g/Tag nicht. Ein übermäßiger Konsum von L-Glutaminsäure kann zu ausgeprägten Intoxikationssymptomen führen, die sich in Kopfschmerzen, Schwindel und starkem Schwitzen im Gesichtsbereich äußern. Daher ist die Bestimmung des L-Glutaminsäuregehalts in Lebensmitteln und klinischen Proben von großer Bedeutung und erforderlich. Zu den traditionell eingesetzten Nachweismethoden für L-Glutaminsäure zählen potentiometrische Titration, Warburg-Respirometrie und chromatographische Analysen. Diese Verfahren sind zeit- und arbeitsintensiv und erfordern hochpräzise Geräte. Vor diesem Hintergrund bietet der Einsatz von Biosensoren zur Detektion von L-Glutaminsäure Vorteile wie kurze Messzeiten, hohe Sensitivität und eine einfache apparative Ausstattung.

Schlussfolgerungen

L-Glutaminsäure-Oxidase ist ein relativ neues, praxisrelevantes Tool-Enzym; über ihren Wirkmechanismus und die dreidimensionale Proteinstruktur liegen bislang nur wenige Berichte vor. Es ist zu erwarten, dass Forschende in naher Zukunft mit dem Fortschritt der Biotechnologie und der molekularen Biotechnologie den Wirkmechanismus aufklären und gentechnisch optimierte Produktionsstämme konstruieren können, die besser für die industrielle Herstellung geeignet sind, sodass das Enzym breiter eingesetzt werden kann und Produktion sowie Lebensqualität zugutekommt.

Literatur