Lysinoxidase

Lysin-Oxidase (EC 1.4.3.14) gehört zur Klasse der Oxidoreduktasen und wirkt auf die CH-NH₂-Gruppe von Donoren. Der systematische Name dieser Enzymklasse lautet L-Lysin:Oxygen-2-Oxidoreduktase. Weitere gebräuchliche Bezeichnungen sind L-Lysin-α-Oxidase und L-Lysyl-α-Oxidase. Die erste Lysin-Oxidase wurde aus Trichoderma viride Y 244-2 isoliert. Später wurde eine weitere Lysin-Oxidase in Trichoderma harzianum Rifai identifiziert.

Physikochemische Eigenschaften

Das Molekulargewicht des Enzyms aus Trichoderma viride Y 244-2 beträgt etwa 120 kDa; das Proteinmolekül besteht aus zwei identischen Untereinheiten zu je 60 kDa. Der isoelektrische Punkt dieses Enzyms liegt bei 4,25. Das Molekulargewicht des Enzyms aus Trichoderma harzianum Rifai beträgt 100 kDa, der isoelektrische Punkt liegt bei 5,6. Die zweite Lysin-Oxidase ist wahrscheinlich ein Produkt der Proteolyse der nativen Lysin-Oxidase. Lysin-Oxidasen enthalten pro Untereinheit ein FAD-Molekül als Coenzym. Ihre optischen Absorptionsspektren zeigen Maxima bei 360 und 460 nm sowie einen Peak bei 280 nm. Das Molekül enthält 3 bis 98 Kohlenhydratreste; mittels Aminosäureanalyse wurden nur 3 von 43 Lysinresten an der Moleküloberfläche nachgewiesen. Dies deutet darauf hin, dass die räumliche Struktur der Lysin-Oxidase dazu tendiert, oberflächenexponierte Aminogruppen zu minimieren. Die Aminogruppen der Lysin-Oxidase sind nicht zugänglich. Der optimale pH-Bereich der Lysin-Oxidase aus Trichoderma harzianum Rifai liegt zwischen 4,5 und 10,5.

Struktur

Die beiden Lysin-Oxidasen weisen unterschiedliche Strukturen auf. Die Lysin-Oxidase aus Trichoderma viride Y 244-2 enthält 13 % α-Helix und 18 % β-Struktur. Die Lysin-Oxidase aus Trichoderma harzianum Rifai enthält 12 % α-Helix und 33 % β-Struktur. Auch die Aminosäurezusammensetzung der beiden Lysin-Oxidasen unterscheidet sich. Die Lysin-Oxidase aus Trichoderma harzianum Rifai enthält etwa 2,6-fach mehr Glycinreste als die Lysin-Oxidase aus Trichoderma viride Y 244-2. Dagegen sind die Tryptophan- und Argininreste im Vergleich zur Lysin-Oxidase aus Trichoderma viride Y 244-2 etwa um den Faktor 4 bzw. 2 geringer.

Stabilität

Der Test zur thermischen Stabilität der Lysin-Oxidase aus Trichoderma harzianum Rifai zeigte, dass dieses Enzym im Vergleich zur Lysin-Oxidase aus Trichoderma viride Y 244-2 eine geringe thermische Stabilität aufweist. Nach Inkubation bei 75 und 80 °C schreitet die Inaktivierung sehr schnell voran. Die thermische Stabilität der Lysin-Oxidase nimmt in verdünnten Lösungen signifikant zu. Kinetische Kurven zeigten, dass sich die thermische Inaktivierung deutlich verlangsamt, wenn das Enzym in Untereinheiten dissoziiert. Der Mechanismus der Inaktivierung der Lysin-Oxidase deutet darauf hin, dass das Enzym als verdünnte Lösung gelagert werden sollte. Bei lyophilisierter Lagerung bei 4 °C oder als gefrorene Lösung bei −18 °C behielt das Enzym seine Aktivität über ein Jahr konstant bei.

Katalytischer Mechanismus

Lysin-Oxidase wirkt ausschließlich auf L-Lysin und ist mit einem niedrigen K_m an dessen Abbau beteiligt. Während der Reaktion wird Sauerstoff verbraucht und es entstehen Ammoniak, Wasserstoffperoxid und α-Keto-ε-Aminocapronsäure; α-Keto-ε-Aminocapronsäure kann spontan in ein zyklisches Derivat überführt werden. Die Oxidation von Lysin und die Bildung von Wasserstoffperoxid bilden die Grundlage der physiologischen Effekte der Lysin-Oxidase.

Abbildung 1. Katalytischer Mechanismus der Lysin-Oxidase. (Lukasheva E.V. 2002)

Physiologische Effekte

In vitro hemmt Lysin-Oxidase die Synthese von DNA, RNA und Proteinen bei Leukämie, humanem Ovarialkarzinom und Burkitt-Lymphom. Darüber hinaus haben in vitro-Experimente gezeigt, dass Lysin-Oxidase antiinvasive, antibakterielle und antivirale Effekte besitzt. Sie hemmte die Replikation des Herpes-simplex-Virus Typ I und unterdrückte zudem die Expression viraler Antigene. Nach Injektion von Lysin-Oxidase in Mäuse wurde beobachtet, dass Lysin-Oxidase in vivo eine hohe Aktivität aufweist; ihre Konzentration zeigt einen zeitabhängigen Effekt, und die Halbwertszeit beträgt 2 h. Zudem zeigt Lysin-Oxidase in vivo eine immunmodulatorische Wirkung, einen antiviralen therapeutischen Effekt sowie antitumorale und antimetastatische Effekte. Lysin-Oxidase ist für viele Tumorzelllinien hoch zytotoxisch und zeigt bereits in sehr kleinen Dosen anti-leukämische und antimetastatische Wirkungen. Experimente an Mäusen mit Lewis-Lungenkarzinom zeigten, dass der antimetastatische Effekt der Lysin-Oxidase mit steigender Dosis zunimmt und dosisabhängig ist. Darüber hinaus kann Lysin-Oxidase die Zellmembran von Makrophagen beeinflussen.

Anwendungen

Als essenzielle Aminosäure ist Lysin ein wichtiger Bestandteil von Nahrungsergänzungen. Das breite Spektrum industrieller Anwendungen erfordert eine einfache und spezifische Bestimmung der Lysinkonzentrationen in Kulturen und Endprodukten. Lysin-Oxidase wirkt ausschließlich auf Lysin und hat keinen Einfluss auf andere Aminosäuren. Daher wird dieses Enzym zur Bestimmung des Lysingehalts eingesetzt. Lysin-Oxidase und Meerrettichperoxidase werden zur Analyse der Lysinkonzentration auf einer porösen Trägermembran immobilisiert. Die Membran kann wiederholt verwendet werden; die Sensitivität liegt zwischen 20 und 120 µM, und die Reaktionszeit beträgt 2–20 min.

Referenz