MNase

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Einführungen

Mikrokokkale Nuklease (Mnase) ist eine Nuklease, die nur DNA im nukleosomalen Verbindungsbereich abbaut und nicht abgebaut wird, da die DNA am Nukleosom durch Histon 1 geschützt ist. Mikrokokkale Nuklease stammt von Staphylococcus aureus und ist eine relativ unspezifische Endo-Exonuklease. Sie wird aus einem rekombinanten E. coli-Stamm gereinigt, der doppelsträngige, einzelsträngige, zirkuläre und lineare Nukleinsäuren abbaut. Das Enzym ist im pH-Bereich von 7,0 - 10,0 aktiv, mit optimaler Aktivität bei pH 9,2 für sowohl RNA- als auch DNA-Substrate. Spaltpräferenzen wurden an Stellen beobachtet, die reich an Adenylat, Deoxyadenylat oder Thymidylat sind. Sowohl DNA als auch RNA werden zu 3'-Phosphomononukleotiden und Dinukleotiden abgebaut.

Quelle

Dieses Enzym ist eine extrazelluläre Nuklease von Staphylococcus aureus. Eine häufige Quelle sind E. coli-Zellen, die ein kloniertes nukleäres Gen tragen, das eine S. aureus-extrazelluläre Nuklease (mikrokokkale Nuklease) kodiert.

Struktur

Die 3-dimensionale Struktur der mikrokokkalen Nuklease (damals bekannt als staphylokokkale Nuklease) wurde früh in der Geschichte der Protein-Kristallographie gelöst, und hochauflösende, neuere Kristallstrukturen sind für Apo-Formen verfügbar, wie die Protein Data Bank-Datei 1SNO: und thymidindiphosphat-reprimierte Formen, wie die Protein Data Bank-Dateien 3H6M und 1SNC. Nuklease-Moleküle haben 3 lange Alpha-Helices und eine 5-verknüpfte fassförmige Beta-Lamelle, in einer Anordnung, die als OB-Faltung (Oligonukleotid-bindende Faltung) bekannt ist.

Mikrokokkale Nuklease Verfahren

• Erhalten Sie das Zielgen

1. Durch PCR-Methode: Unter Verwendung des klonierten Plasmids, das das Zielgen enthält, als Vorlage, wird ein Primerpaar gemäß der Gen-Sequenz entworfen (verschiedene enzymatische Stellen werden in den upstream und downstream Primern eingeführt) und der PCR-Zyklus wird durchgeführt, um das gewünschte Genfragment zu erhalten.
2. Durch RT-PCR-Methode: Gesamt-RNA aus Zellen oder Geweben durch TRIzol-Methode extrahieren, mRNA als Vorlage verwenden, um die erste Strang cDNA zu reversen transkribieren, und das Produkt der reversen Transkription als Vorlage für den PCR-Zyklus verwenden, um das Produkt zu erhalten.

• Konstruktion des rekombinanten Expressionsvektors

1. Mikrokokkale Nuklease Vektorverdau: Der Expressionsplasmid wurde doppelt mit Restriktionsendonuklease (gleiche Primerstelle) verdaut, und das verdautes Produkt wurde durch Agarose-Elektrophorese zurückgewonnen, und das Vektorfragment wurde durch Gel-Rückgewinnungs-Kit oder Gefrier-Tau-Methode zurückgewonnen.
2. Die PCR-Produkte wurden nach der doppelten Verdauung zurückgewonnen und mit T4-DNA-Ligase in den Vektor ligiert.

• Erhalten Sie den Expressionsstamm, der das rekombinante Expressionsplasmid enthält

1. Transformieren Sie das ligierte Produkt in E. coli DH5α, screenen Sie den rekombinanten Vektor gemäß seinem Marker (anti-Amp oder blau-weißer Fleck), wählen Sie einen einzelnen Fleck aus, extrahieren Sie eine kleine Menge Plasmid durch alkalische Lyse und führen Sie eine doppelte Verdauung zur vorläufigen Identifizierung durch.
2. Sequenzierung zur Überprüfung, ob die Einfüge-Richtung und der Leserahmen des Zielgens korrekt sind, um den nächsten Schritt zu betreten. Andernfalls sollten weitere Klone gescreent werden, wiederholen Sie das Subklonieren oder klonieren Sie an andere enzymatische Stellen.
3. Verwenden Sie diese rekombinante Plasmid-DNA, um die Rezeptorzellen der Wirtsbakterien zu transformieren.

• Induktion der Expression

Anwendungen

• Hydrolyse von Nukleinsäuren in zellfreien Rohextrakten.
• RNA-Sequenzierung.
• Vorbereitung von doppelsträngigen DNA-Fragmenten mit 5'-OH und 3'-Phosphat.
• Studien zur Chromatinstruktur.
• Abbau von Nukleinsäuren in Roh-zellfreien Extrakten.
• Vorbereitung von Kaninchen-Retikulozyten-Lysaten.
• Studien zur Chromatinstruktur.
• Entfernung von Nukleinsäuren aus Labor-Proteinpräparaten für Studien zur Protein-Faltung und Struktur-Funktion.
• Studien zu Mechanismen der Protein-Faltung.