MNase

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Einleitung

Mikrokokken-Nuklease (MNase) ist eine Nuklease, die ausschließlich DNA in den nukleosomalen Linker-/Junction-Regionen abbaut; die im Nukleosom gebundene DNA wird aufgrund des Schutzes durch Histone (insbesondere Histon H1) nicht degradiert. Die Mikrokokken-Nuklease stammt aus Staphylococcus aureus und ist eine relativ unspezifische Endo-/Exonuklease. Sie wird aus einem rekombinanten E. coli-Stamm aufgereinigt und spaltet doppelsträngige, einzelsträngige, zirkuläre und lineare Nukleinsäuren. Das Enzym ist im pH-Bereich von 7,0–10,0 aktiv, mit optimaler Aktivität bei pH 9,2 sowohl für RNA- als auch für DNA-Substrate. Bevorzugte Spaltstellen wurden in adenylat-, desoxyadenylat- oder thymidylatreichen Sequenzabschnitten beobachtet. Sowohl DNA als auch RNA werden zu 3'-Phosphomononukleotiden und Dinukleotiden abgebaut.

Herkunft

Dieses Enzym ist eine extrazelluläre Nuklease von Staphylococcus aureus. Eine gängige Quelle sind E. coli-Zellen, die ein kloniertes Gen tragen, das für eine extrazelluläre Nuklease von S. aureus (Mikrokokken-Nuklease) kodiert.

Struktur

Die 3D-Struktur der Mikrokokken-Nuklease (damals als staphylokokkale Nuklease bezeichnet) wurde früh in der Geschichte der Proteinkristallographie aufgeklärt; neuere Kristallstrukturen mit höherer Auflösung liegen für Apo-Formen vor, z. B. Protein-Data-Bank-Eintrag 1SNO, sowie für durch Thymidindiphosphat inhibierte Formen, z. B. Protein-Data-Bank-Einträge 3H6M und 1SNC. Nuklease-Moleküle besitzen drei lange Alpha-Helices und fünf verknüpfte, tonnenförmig angeordnete Beta-Faltblätter in einer Anordnung, die als OB-Fold (Oligonukleotid-Bindungs-Fold) bekannt ist.

Verfahren für Mikrokokken-Nuklease

• Zielgen gewinnen

1. Mittels PCR: Unter Verwendung des klonierten Plasmids mit dem Zielgen als Template wird anhand der Gensequenz ein Primerpaar entworfen (in die Upstream- und Downstream-Primer werden unterschiedliche Restriktionsschnittstellen eingeführt) und die PCR durchgeführt, um das gewünschte Genfragment zu erhalten.
2. Mittels RT-PCR: Gesamt-RNA wird aus Zellen oder Geweben nach der TRIzol-Methode isoliert; mRNA wird als Template verwendet, zur Synthese des ersten cDNA-Strangs revers transkribiert und das Reverse-Transkriptionsprodukt anschließend als Template für die PCR eingesetzt, um das Produkt zu erhalten.

• Rekombinanten Expressionsvektor konstruieren

1. Restriktionsverdau des Mikrokokken-Nuklease-Vektors: Das Expressionsplasmid wird mittels Restriktionsendonukleasen (entsprechend den Primerschnittstellen) doppelt verdaut; das Verdauprodukt wird per Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und das Vektorfragment mittels Gel-Extraktionskit oder Freeze-Thaw-Methode zurückgewonnen.
2. Die PCR-Produkte werden nach Doppelverdau aufgereinigt und mittels T4-DNA-Ligase in den Vektor ligiert.

• Expressionsstamm mit rekombinantem Expressionsplasmid erhalten

1. Das Ligationsprodukt wird in E. coli DH5α transformiert; der rekombinante Vektor wird anhand seines Markers (Ampicillin-Resistenz oder Blau-Weiß-Selektion) selektiert, eine einzelne Kolonie wird gepickt, eine geringe Plasmidmenge mittels alkalischer Lyse isoliert und zur vorläufigen Identifizierung einem Doppelverdau unterzogen.
2. Durch Sequenzierung wird verifiziert, dass Insertionsrichtung und Leserahmen des Zielgens korrekt sind; anschließend erfolgt der nächste Schritt. Andernfalls sind weitere Klone zu screenen und das Subklonieren zu wiederholen bzw. über alternative Restriktionsschnittstellen durchzuführen.
3. Mit dieser rekombinanten Plasmid-DNA werden die Empfängerzellen des Wirtsbakteriums transformiert.

• Expressionsinduktion

Anwendungen

• Hydrolyse von Nukleinsäuren in zellfreien Rohlysaten.
• RNA-Sequenzierung.
• Herstellung doppelsträngiger DNA-Fragmente mit 5'-OH und 3'-Phosphat.
• Untersuchungen der Chromatinstruktur.
• Abbau von Nukleinsäuren in zellfreien Rohlysaten.
• Herstellung von Kaninchen-Retikulozytenlysaten.
• Chromatinstruktur-Studien.
• Entfernung von Nukleinsäuren aus Labor-Proteinpräparationen für Studien zur Proteinfaltung sowie Struktur-Funktions-Analysen.
• Studien zu Mechanismen der Proteinfaltung.