Nitratreduktase

Nitratreduktasen (NR, EC 1.6.6.1-3), das erste Enzym für die Nitratassimilation, ist ein Multidomain-Protein, das in der Lage ist, die Elektronenspende von NAD(P)H an künstliche Akzeptoren und Redoxproteine zu vermitteln. Die enzymatische Reduktion von Nitrat (NO3−) zu Nitrit (NO2−) durch NR ist entscheidend für die Stickstoffaufnahme in den meisten Kulturpflanzen, da das Hauptsubstrat Nitrat für die Signalgebung erforderlich ist und als primäre Stickstoffquelle in gedüngten Böden dient. NR ist ein zentraler Punkt in Pflanzen, Algen und Pilzen für die Integration des Stoffwechsels, indem es den Fluss von reduziertem Stickstoff durch mehrere Regulationsmechanismen steuert. NR besteht aus prosthetischen Gruppen wie Molybdopterin, Fe-Häm und FAD (Flavin-Adenin-Dinukleotid) in einem Verhältnis von 1:1:1, wobei die FAD- und Mo-Pterin-Domänen die Bindungsstellen für NAD(P)H und NO3− sind. Die Cytochrom b5-ähnliche Häm-Domäne beschleunigt den Elektronentransfer von der FAD-Domäne zur aktiven Stelle Mo-Pterin.

Struktur

Das NR-Monomer besteht aus einem ~100-kD Polypeptid, Häm-Eisen, Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD) und Molybdän-Molybdopterin (Mo-MPT). Acht Sequenzsegmente von NR sind die N-terminale "saure" Region, die Mo-MPT-Domäne mit der nitratreduzierenden aktiven Stelle, die Schnittstellendomäne, das Scharnier 1, das Serin enthält, das in der reversiblen Aktivitätsregulation phosphoryliert wird und durch das Bindungsprotein 14-3-3 gehemmt wird, die Cytochrom b-Domäne, das Scharnier 2, die FAD-Domäne und die NAD(P)H-Domäne. Ein dreidimensionales dimeres NR-Strukturmodell wurde aus den Strukturen von Sulfitoxidase und Cytochrom b-Reduktase konstruiert.

Abbildung 1. Struktur der Nitratreduktase. (Campbell W H. 1996)

Es ist bemerkenswert, dass eine transmembranäre respiratorische NR drei Untereinheiten enthält; eine Alpha-, eine Beta- und zwei Gamma-Untereinheiten. Sie dient als die zweite Nitratreduktase, die die anaerobe NR in Escherichia coli ersetzt, wodurch sie als Protonenpumpe fungieren und Nitrat als Elektronenakzeptor während der anaeroben Atmung nutzen kann. Die NR-Gamma-Untereinheit ähnelt Cytochrom b und überträgt Elektronen von Chinonen auf die Beta-Untereinheit. Die NR höherer Pflanzen gehört zu einem zytosolischen Protein, das eine GPI-ankergelagerte Variante hat, die auf der äußeren Seite der Plasmamembran zu finden ist.

Klassifikation

Eukaryotische NRs sind Teil der Sulfitoxidase-Familie der Molybdoenzyme und sind in der Lage, Elektronen von NADH oder NADPH auf Nitrat zu übertragen.

Prokaryotische NRs sind ein Mitglied der DMSO-Reduktase-Familie der Molybdoenzyme. Sie wurden in drei Gruppen unterteilt, darunter assimilatorische Nitratreduktasen (Nas), respiratorische Nitratreduktasen (Nar) und periplasmatische Nitratreduktasen (Nap), deren aktive Stelle ein Mo-Ion ist, das für die vier Thiolatfunktionen von zwei Pterin-Molekülen verantwortlich ist. Das Mo wird durch eine Aminosäure-Seitenkette und Sauerstoff- und/oder Schwefel-Liganden koordiniert und ist kovalent an das Protein durch einen Cystein-Liganden in Nap und einen Aspartat in Nar gebunden. Die genaue Umgebung des Mo-Ions in bestimmten dieser Enzyme ist noch umstritten.

Mechanismus

Das Nitratmolekül bindet an die aktive Stelle mit dem Mo-Ion im Oxidationszustand +6. Der Elektronentransfer zur aktiven Stelle wird nur in der Protonen-Elektron-Transfer-Phase abgeschlossen, in der die MoV-Spezies entscheidend für die Katalyse sind. Das vorhandene Schwefelatom in der Koordinationssphäre des Molybdäns könnte ein pseudo-Dithiolene-Ligand erzeugen, der es vor Angriffen durch das Lösungsmittel schützt. Bei der Bindung von Nitrat tritt eine konformationale Umordnung dieses Rings auf, die durch die konservierten Methionine Met141 und Met308 stabilisiert wird. Diese Umordnung ermöglicht die direkte Wechselwirkung des Nitrats mit dem MoVI-Ion. Im zweiten Schritt des Mechanismus erfolgt die Reduktion von Nitrat zu Nitrit, wobei die Oxidation der Schwefelatome und nicht des Molybdäns erfolgt. Die beiden Dimethyl-Dithiolene-Liganden sind entscheidend für die Verteilung der übermäßigen negativen Ladung in der Nähe des Mo-Atoms, um es für die chemische Reaktion verfügbar zu machen. Der Mechanismus impliziert eine Molybdän- und schwefelbasierte Redox-Chemie anstelle der weit verbreiteten akzeptierten Redox-Chemie, die nur auf dem Mo-Ion basiert. Der zweite Teil des Mechanismus umfasst zwei Protonierungsstufen, die durch die Anwesenheit von MoV-Spezies erleichtert werden. Je nach Verfügbarkeit von Protonen und Elektronen könnten in dieser Phase auch MoVI-Intermediäre vorhanden sein. Sobald das Wassermolekül produziert wird, könnte nur die MoVI-Spezies die Dissoziation des Wassermoleküls zusammen mit der damit verbundenen enzymatischen Umwandlung durchführen.

Abbildung 2. Vorgeschlagener Mechanismus für die Nitratreduktion durch respiratorische Nitratreduktasen. (Coelho C; et al. 2015)

Anwendungen

Die Reduktion von Nitrat zu Nitrit durch Nitratreduktase und die Reduktion von Nitrit zu Ammonium durch Nitritreduktase sind zwei wichtige Verfahren in der biologischen Umwandlung von anorganischem Nitrat zu Ammonium, einem Acht-Elektronen-Reduktionsprozess. NR wurde als wichtige enzymatische Quelle von Stickstoffmonoxid (NO) vorgeschlagen. NR spielt auch eine Rolle in der NO-Homöostase, indem es Elektronen von NAD(P)H durch seine Diaphorase/Dehydrogenase-Domäne an ein verkürztes Hämoglobin THB1 überträgt, das NO durch seine Dioxygenase-Aktivität scavenged, und an das Molybdoenzym NO-bildende Nitritreduktase (NOFNiR), das für die NO-Synthese aus Nitrit verantwortlich ist. Die Homöostase des entscheidenden Signalmoleküls NO in photosynthetischen Organismen hängt von zwei Schlüssel-Molybdoenzymen, NR und NOFNiR, sowie von der Dioxygenase-Potenz von Hämoglobinen ab.

Die NR-Aktivität kann als biochemisches Werkzeug verwendet werden, um den Ertrag von Regen und die Produktion von Getreideprotein vorherzusagen. NR erhöht auch die Aminosäureproduktion in Teeblättern. Unter den Bedingungen im südlichen Indien wurde berichtet, dass Teepflanzen, die mit verschiedenen Mikronährstoffen zusammen mit Mo besprüht wurden, einen erhöhten Aminosäuregehalt in den Teetrieben und auch einen erhöhten Ertrag aufweisen.

Literaturverzeichnis