Polyphosphat-Kinase

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Einleitung

Anorganisches Polyphosphat (polyP) ist ein lineares P_i-Polymer, das über Phosphoanhydridbindungen verknüpft ist. Es kommt in allen Zellen der Natur vor, und Studien haben gezeigt, dass es möglicherweise seit präbiotischen Zeiten konserviert ist. Die Bedeutung von polyP in Bakterien ist umfassend bestätigt. Unter Nährstofflimitierung und Umweltstress produzieren viele gramnegative Bakterien polyP rasch. PolyP erfüllt multiple Funktionen: Es kann die Expression von rpoS und recA auf transkriptioneller Ebene regulieren und die Expression zahlreicher stressinduzierbarer sowie stationärphaseninduzierbarer Gene beeinflussen. PolyP reguliert zudem den Abbau ribosomaler Proteine über die Lon-Protease.  

Unklar ist, wie diese Mangelzustände und Stresssignale zur Akkumulation von polyP führen. Die Polyphosphatkinase (PPK, auch als PPK1 bezeichnet) katalysiert die reversible Übertragung des γ-Phosphats von ATP auf polyP. Deletionsstudien des ppk-Gens in wichtigen humanpathogenen Erregern (z. B. Pseudomonas aeruginosa) haben die Relevanz von polyP und PPK für die bakterielle Pathogenese belegt. PPK ist außerdem essenziell für Motilität, Biofilmbildung und Quorum Sensing und leistet damit wesentliche Beiträge zur Antibiotikaresistenz von Pathogenen. Hervorzuheben ist, dass auch die Freisetzung von Virulenzfaktoren die Beteiligung von PPK erfordert. Da polyP für das Überleben in der Stationärphase notwendig ist, könnten PPK-Inhibitoren zur Eradikation nicht proliferierender Bakterien beitragen. Derzeit ist die PPK aus E. coli als Enzym vollständig charakterisiert. Die gereinigte rekombinante PPK katalysiert weiterhin die Verlängerung von polyP und beendet die katalytische Reaktion, wenn die polyP-Kette etwa 750 Phosphatgruppen erreicht.

Gesamtstruktur der Escherichia coli-PPK

Die Kristallstruktur der vollständigen E. coli-PPK wurde sowohl in unligandierter Form als auch in AMPPNP-gebundener Form im selben Kristallgitter mit einer Auflösung von 2,5 Å bestimmt. Im Kristallgitter enthält jede asymmetrische Einheit zwei PPK-Monomere mit im Wesentlichen identischer Struktur, die durch eine Pseudo-Zweifachsymmetrie miteinander in Beziehung stehen und eine ineinander verschränkte Dimerstruktur bilden. Bei Bindung von AMPPNP an PPK ändert sich die Konformation des Monomers nur geringfügig. Jedes PPK-Monomer weist eine L-förmige Struktur mit vier Domänen auf. Dazu gehören die aminoterminale Domäne, die „Kopf“-Domäne (H-Domäne) sowie zwei eng verwandte carboxyterminale Domänen (C1- und C2-Domäne). Die N-Domäne umfasst die Reste 2–106 und besteht aus einem Bündel aus drei antiparallelen langen α-Helices, die auf der oberen Oberfläche der C-terminalen Domäne liegen. Die N-Domäne ist eine hochkonservierte Region der PPK und stellt die obere Bindungsoberfläche für den Adeninring von ATP bereit. Die C1- und C2-Domänen bestehen aus den Resten 322–502 bzw. 503–687 und sind innerhalb der PPK-Familie hochkonserviert; Helix und β-Faltblatt weisen unterschiedliche strukturelle Topologien und relative Orientierungen auf. Studien haben gezeigt, dass sich einige für die enzymatische katalytische Aktivität essenzielle Aminosäurereste in diesen beiden Domänen befinden.

Abbildung 1. Gesamtstruktur der Polyphosphatkinase (PPK) aus Escherichia coli (Zhu, Y.; et al. 2015)

Chemischer Mechanismus der Autophosphorylierung von PPK

Es wurde gezeigt, dass die Autophosphorylierung von PPK den ersten Schritt der polyP-Synthese darstellt, und Mutagenesestudien haben ergeben, dass H435 und H454 potenzielle Autophosphorylierungsstelle(n) von PPK sein könnten. In der PPK-AMPPNP-Kristallstruktur interagiert H435 direkt mit der γ-Phosphatgruppe von AMPPNP aus der „umgekehrten“ Position, während H454 vollständig im hydrophoben Kern der C1-Domäne verborgen ist. Dieses Ergebnis liefert Evidenz dafür, dass H435 die einzige Autophosphorylierungsstelle von PPK ist. Einige Wissenschaftler postulieren, dass H435 der PPK als Nukleophil dient, um die Phosphodiesterbindung der γ-Phosphatgruppe von ATP anzugreifen, während H592 als allgemeine Säure fungiert und das Sauerstoffatom zwischen β- und γ-Phosphat protoniert. In den C1- und C2-Domänen bilden vier hochkonservierte Aminosäuren Schlüssel-Wasserstoffbrückenbindungen: E623 mit H435 sowie D470 mit H592. Die mögliche Rolle von D470 besteht darin, die allgemeine Säure H592 zu binden und korrekt zu orientieren. Dieses Modell steht im Einklang mit Ergebnissen früherer biochemischer Untersuchungen, wonach die Mutanten H435Q und H592Q nicht zur Autophosphorylierung fähig waren.

Abbildung 2. Der vorgeschlagene chemische Mechanismus der Autophosphorylierung von PPK (Zhu, Y.; et al. 2015)