Polyphosphat-Kinase

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Einführung

Inorganisches Polyphosphat (polyP) ist ein linearer P_i Polymer, der durch Phosphoanhydridbindungen verknüpft ist. Es kommt in allen Zellen der Natur vor, und Studien haben gezeigt, dass es möglicherweise aus präbiotischen Zeiten erhalten geblieben ist. Die Bedeutung von polyP in Bakterien ist vollständig bestätigt. Unter ernährungsbedingten Einschränkungen und Umweltstress werden viele gramnegative Bakterien schnell polyP produzieren. PolyP hat mehrere Funktionen, die die Expression von rpoS und recA auf transkriptioneller Ebene regulieren und die Expression vieler stressinduzierbarer und stationärphasenspezifischer Gene beeinflussen können. PolyP reguliert auch den Abbau von ribosomalen Proteinen durch die Lon-Protease.   

Es ist unklar, wie diese Defizite und Stresssignale zur Ansammlung von polyP führen. Polyphosphatkinase (PPK, auch bekannt als PPK1) ist verantwortlich für die Katalyse der reversiblen Umwandlung der γ-Phosphatgruppe von ATP zu polyP. Deletionsversuche des ppk Gens in wichtigen menschlichen Krankheitserregern (wie Pseudomonas aeruginosa) haben die Bedeutung von polyP und PPK in der bakteriellen Pathogenese demonstriert. PPK ist auch entscheidend für die Beweglichkeit, Biofilmbildung und Quorum-Sensing, was wichtige Beiträge zur Antibiotikaresistenz von Krankheitserregern leistet. Es ist erwähnenswert, dass die Freisetzung von Virulenzfaktoren ebenfalls die Teilnahme von PPK erfordert. Da polyP für das Überleben in der stationären Phase erforderlich ist, könnten PPK-Inhibitoren helfen, nicht sich teilende Bakterien zu eradizieren. Derzeit ist E. coli PPK ein vollständig charakterisiertes Enzym. Das gereinigte rekombinante PPK katalysiert weiterhin die Verlängerung von polyP und beendet die katalytische Reaktion, wenn die polyP-Kette etwa 750 Phosphatgruppen erreicht.

Gesamtstruktur von Escherichia coli PPK

Die Kristallstruktur des vollwertigen E. coli PPK sowohl in unligandierter als auch in AMPPNP-gebundener Form wurde im selben Kristallgitter bei 2,5 Å Auflösung bestimmt. Im Kristallgitter enthält jede asymmetrische Einheit zwei PPK-Monomere mit im Wesentlichen derselben Struktur, die durch pseudo-zweifache Symmetrie miteinander verbunden sind und eine ineinandergreifende Dimerstruktur bilden.  Wenn AMPPNP mit PPK kombiniert wird, ändert sich die Konformation des Monomers nur geringfügig. Jedes PPK-Monomer hat eine L-förmige Struktur mit vier Domänen. Diese Domänen umfassen die aminoterminale Domäne, die "Kopf"-Domäne (H-Domäne) und zwei eng verwandte carboxyterminale Domänen (C1- und C2-Domänen).  Die N-Domäne umfasst die Reste 2-106, die aus einem Bündel von drei antiparallelen langen α-Helices bestehen, die sich auf der oberen Fläche der C-terminalen Domäne befinden. Die N-Domäne ist ein hochkonservierter Bereich von PPK und bietet die obere Bindungsoberfläche für den Adeninring von ATP. Die C1- und C2-Domänen bestehen aus den Resten 322-502 und 503-687 und sind in der PPK-Familie hochkonserviert; die Helix und das β-Faltblatt haben unterschiedliche strukturelle Topologien und relative Orientierungen. Studien haben gezeigt, dass einige Reste, die für die katalytische Aktivität des Enzyms unerlässlich sind, in diesen beiden Domänen lokalisiert sind.

Abbildung 1. Gesamtstruktur der Escherichia coli Polyphosphatkinase (PPK) (Zhu, Y.; et al. 2015)

Chemischer Mechanismus der PPK-Autophosphorylierung

Es wurde gezeigt, dass die Autophosphorylierung von PPK der erste Schritt in der Polyphosphatsynthese ist, und Mutagenesestudien haben gezeigt, dass H435 und H454 die Autophosphorylierungsstelle(n) von PPK sein könnten. In der PPK-AMPPNP-Kristallstruktur interagiert H435 direkt mit der AMPPNP γ-Phosphatgruppe aus der "umgekehrten" Position, während H454 vollständig im hydrophoben Kern der C1-Domäne verborgen ist. Dieses Ergebnis liefert Beweise dafür, dass H435 die einzige Autophosphorylierungsstelle von PPK ist.  Einige Wissenschaftler spekulieren, dass H435 von PPK als Nucleophil verwendet wird, um die Phosphodiesterbindung der γ-Phosphatgruppe von ATP anzugreifen, während H592 als allgemeine Säure fungiert, die das Sauerstoffatom zwischen β- und γ-Phosphat protoniert. Es gibt vier hochkonservierte Aminosäuren, die Schlüsselwasserstoffbrücken in den C1- und C2-Domänen bilden: E623 mit H435, D470 mit H592. Die mögliche Rolle von D470 besteht darin, die allgemeine Säure H592 zu binden und korrekt auszurichten. Dieses Modell stimmt mit den Ergebnissen früherer biochemischer Studien überein, dass die Mutanten H435Q und H592Q nicht in der Lage waren, sich autophosphorylieren.

Abbildung 2. Der vorgeschlagene chemische Mechanismus für die PPK-Autophosphorylierung (Zhu, Y.; et al. 2015)