Proteinase K

Proteinase K ist ein typisches Mitglied der Subtilisin-Familie der Proteasen (S8). Die Aminosäuresequenz wird durch Edman-Abbau und Gen-Sequenzierung erhalten. Die Polypeptidkette besteht aus 278 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 28.930 und einem pI von 8,9. Proteinase K ist eine Endopeptidase und trägt die katalytischen Triaden Asp39, His69, Ser224 an seiner aktiven Stelle. Die volle Enzymaktivität erfordert das Vorhandensein von Calciumionen. Die maximale Aktivität liegt im pH-Bereich von 7,5-12,0. Wenn eine Einheit 1μmol von Ac-Tyr-OEt pro Minute in Tris-HCl-Puffer bei pH 9,3 und 30°C hydrolysiert, beträgt die spezifische Aktivität etwa 300 Umg21. Peptidylchloromethan und Hg21 wirken als Inhibitoren, wobei 7% Hg21 selbst im Überschuss aktiv bleibt. Proteinase K löst sich bei niedrigen Konzentrationen (~0,01mg/ml), ist jedoch bei Konzentrationen über 1,0mg/ml stabiler.

Abbildung 1. Struktur von Proteinase K.

Inhibitor

Protease K ist eine Serinprotease, daher kann ihre Wirkung mit Benzylsulfonylfluorid, einem Inhibitor der Serinprotease, gehemmt werden.

Abbildung 2. Chemische Struktur von Benzylsulfonylfluorid.

Funktionen

Es ist erwähnenswert, dass Proteinase K normalerweise in der Vorhybridisierungsverarbeitung in der In-situ-Hybridisierungstechnologie verwendet wird. Sie hat die Wirkung, das Ziel-DNA-Protein zu verdauen und zu umgeben, um die Chance zu erhöhen, dass die Sonde an die Zielnukleinsäure bindet und das Hybridisierungssignal verbessert. Wenn die Konzentration von Proteinase K jedoch zu hoch ist, die Verdauungszeit zu lang oder die Inkubationstemperatur zu hoch ist, kann dies die Struktur der Zellen bis zu einem gewissen Grad schädigen, was zum Abblättern von Gewebeschnitten und zum Verschwinden des Zellkerns führt, was die Ergebnisse der Hybridisierung beeinträchtigt. EDTA-Puffer kann die Rolle von Proteinase K ersetzen. Diese Probleme lösen und den idealen Färbeeindruck erreichen.

Eigenschaften

Proteinase K ist eine Serinprotease mit einem breiten Spektrum an Spaltaktivitäten. Sie spaltet carboxy-terminal Peptidbindungen von aliphatischen und aromatischen Aminosäuren. Dieses Enzym wurde gereinigt, um RNase- und DNase-Aktivität zu entfernen. Da Proteinase K in Harnstoff und SDS stabil ist und die Fähigkeit hat, natürliche Proteine abzubauen, wird es weit verbreitet eingesetzt, einschließlich der Vorbereitung von chromosomaler DNA für Puls-Elektrophorese, Western Blotting und der Entfernung von Nukleasen in der DNA- und RNA-Vorbereitung. Die allgemeine Arbeitskonzentration von Proteinase K beträgt 50-100 μg/ml. Es ist über einen breiten pH-Bereich aktiv (pH 4-12,5).

Empfohlener Reaktionspuffer: 50mM Tris-HCl (pH7,5), 10mM CaCl₂.

Standard für die Zubereitung von Proteinase K: 20mg/ml Standard für die Zubereitung von Proteinase K: Fügen Sie 200mg Proteinase K zu 9,5ml Wasser hinzu und schütteln Sie vorsichtig, bis die Proteinase K vollständig gelöst ist. Nicht vortexen, um zu mischen. Wasser hinzufügen, um auf 10ml aufzufüllen, dann aliquotieren und bei -20°C lagern.

Lagerung von Proteinase K: Bei -20°C im Kühlschrank lagern, wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen vermeiden und 12 Monate effektiv garantieren.

Die Inkubationstemperatur liegt zwischen 55 und 65°C, die ideale Inkubationstemperatur beträgt 58°C, die Inkubationszeit beträgt 15 Minuten bis 48 Stunden; die ideale Inkubationszeit beträgt 2 Stunden.

Anwendungen

Proteinase K wird in der Leder-, Pelz-, Seiden-, Medizin-, Lebensmittel- und Brauindustrie weit eingesetzt. Die Haarentfernung und -weichmachung in der Lederindustrie haben umfangreiche Verwendung von Proteasen gefunden, was Zeit spart und die Arbeitshygiene verbessert. Proteasen können auch für das Entgummen von Seide, die Zartmachung von Fleisch und die Klärung von Wein verwendet werden. Sie kann klinisch verwendet werden, wie Pepsin zur Behandlung von Verdauungsstörungen, Bronchitis mit saurer Protease, Vaskulitis mit Elastase und die Reinigung von chirurgischen eitrigen Wunden mit Trypsin und Chymotrypsin sowie die Behandlung von Adhäsionen im Interthorax. Enzymhaltiges Waschmittel ist ein neues Produkt in der Reinigungsmittelindustrie. Es enthält alkalische Proteasen, die Blut- und Eiweißflecken auf Kleidung entfernen können. Es ist jedoch darauf zu achten, dass bei der Verwendung kein Kontakt mit der Haut erfolgt, um das Protein auf der Hautoberfläche nicht zu schädigen und Allergien wie Ausschlag und Ekzeme zu verursachen.

Referenz