Proteinase K

Proteinase K ist ein typischer Vertreter der Subtilisin-Familie der Proteasen (S8). Die Aminosäuresequenz wurde mittels Edman-Abbau und Gen-Sequenzierung bestimmt. Die Polypeptidkette besteht aus 278 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 28.930 und einem pI von 8,9. Proteinase K ist eine Endopeptidase und besitzt im aktiven Zentrum die katalytische Triade Asp39, His69, Ser224. Für die volle Enzymaktivität ist die Anwesenheit von Calciumionen erforderlich. Die maximale Aktivität liegt im pH-Bereich von 7,5–12,0. Wenn eine Einheit 1 μmol Ac‑Tyr‑OEt pro Minute in Tris‑HCl-Puffer bei pH 9,3 und 30 °C hydrolysiert, beträgt die spezifische Aktivität etwa 300 U/mg. Peptidylchloromethan und Hg2+ wirken als Inhibitoren; selbst bei Überschuss bleibt Hg2+ zu 7 % aktiv. Proteinase K löst sich bei niedrigen Konzentrationen (~0,01 mg/ml), ist jedoch bei Konzentrationen über 1,0 mg/ml stabiler.

Abbildung 1. Struktur der Proteinase K.

Inhibitor

Proteinase K ist eine Serinprotease; ihre Wirkung kann daher durch Benzylsulfonylfluorid gehemmt werden, einen Inhibitor von Serinproteasen.

Abbildung 2. Chemische Struktur von Benzylsulfonylfluorid.

Funktionen

Hervorzuheben ist, dass Proteinase K üblicherweise in der Vorbehandlung (Pre-Hybridisierung) der In-situ-Hybridisierung eingesetzt wird. Sie verdaut Proteine, die die Ziel-DNA umgeben bzw. an diese gebunden sind, erhöht dadurch die Wahrscheinlichkeit der Sondenbindung an die Zielnukleinsäure und verbessert das Hybridisierungssignal. Sind jedoch die Konzentration von Proteinase K zu hoch, die Verdauungszeit zu lang oder die Inkubationstemperatur zu hoch, kann dies die Zellstruktur in gewissem Umfang schädigen, was zum Ablösen von Gewebeschnitten und zum Verschwinden der Zellkerne führen kann und damit die Hybridisierungsergebnisse beeinträchtigt. Ein EDTA-Puffer kann die Funktion von Proteinase K ersetzen, die oben genannten Probleme lösen und einen idealen Färbeeffekt erzielen.

Eigenschaften

Proteinase K ist eine Serinprotease mit einem breiten Spektrum an Spaltaktivitäten. Sie spaltet carboxyterminale Peptidbindungen aliphatischer und aromatischer Aminosäuren. Dieses Enzym wurde so aufgereinigt, dass RNase- und DNase-Aktivitäten entfernt wurden. Da Proteinase K in Harnstoff und SDS stabil ist und natürliche Proteine abbauen kann, wird sie breit eingesetzt, u. a. zur Präparation chromosomaler DNA für die Pulsfeldgelelektrophorese, für Western Blotting sowie zur Entfernung von Nukleasen bei der DNA- und RNA-Präparation. Die übliche Arbeitskonzentration von Proteinase K beträgt 50–100 μg/ml. Sie ist über einen weiten pH-Bereich aktiv (pH 4–12,5).

Empfohlener Reaktionspuffer: 50 mM Tris‑HCl (pH 7,5), 10 mM CaCl₂.

Standard zur Herstellung einer Proteinase‑K-Lösung (20 mg/ml): 200 mg Proteinase K zu 9,5 ml Wasser geben und vorsichtig schwenken, bis Proteinase K vollständig gelöst ist. Nicht vortexen. Mit Wasser auf 10 ml auffüllen, anschließend aliquotieren und bei −20 °C lagern.

Lagerung von Proteinase K: Bei −20 °C lagern, wiederholte Einfrier‑/Auftauzyklen vermeiden; Haltbarkeit 12 Monate.

Die Inkubationstemperatur beträgt 55 bis 65 °C; die ideale Inkubationstemperatur liegt bei 58 °C. Die Inkubationszeit beträgt 15 Minuten bis 48 Stunden; die ideale Inkubationszeit beträgt 2 Stunden.

Anwendungen

Proteinase K wird in großem Umfang in der Leder-, Pelz- und Seidenverarbeitung sowie in der Medizin, Lebensmittelindustrie und Brauerei eingesetzt. In der Lederindustrie werden Proteasen umfassend zur Enthaarung und Weichmachung verwendet, wodurch Zeit eingespart und die Arbeitshygiene verbessert wird. Proteasen können zudem zur Entbastung von Seide, zur Zartmachung von Fleisch und zur Klärung von Wein eingesetzt werden. Klinisch finden Proteasen Anwendung, z. B. Pepsin zur Behandlung von Verdauungsstörungen, saure Proteasen bei Bronchitis, Elastase bei Vaskulitis sowie Trypsin und Chymotrypsin zur Reinigung eitriger chirurgischer Wunden und zur Behandlung intrathorakaler Serosaadhäsionen. Enzymhaltiges Waschpulver ist ein neues Produkt im Bereich der Waschmittel. Es enthält alkalische Proteasen, die Blutflecken und proteinbasierte Verschmutzungen aus Kleidung entfernen können. Bei der Anwendung ist jedoch darauf zu achten, Hautkontakt zu vermeiden, um eine Schädigung von Proteinen an der Hautoberfläche und dadurch ausgelöste Allergien wie Hautausschlag und Ekzeme zu verhindern.

Referenz