Rnase

Ribonuklease, allgemein abgekürzt als RNase, ist eine Art von Nuklease, die den Abbau von RNA in kleinere Komponenten katalysiert. RNasen können allgemein in Endoribonukleasen und Exoribonukleasen klassifiziert werden und umfassen einige Unterklassen innerhalb der Enzymtypen EC 2.7 (für die phosphorolytischen Enzyme) und 3.1 (für die hydrolytischen Enzyme). Die aktive Stelle der RNasen sieht aus wie ein Grabenbruch, wo alle aktiven Seitenreste die Wand und den Boden des Tals bilden. Kleine Substrate passen perfekt in die Mitte der aktiven Stelle, was eine perfekte Interaktion mit den Resten ermöglicht. Tatsächlich hat die Stelle eine kleine Krümmung, die auch im Substrat vorkommt. Dennoch sind die meisten Exoribonukleasen und Endoribonukleasen normalerweise nicht sequenzspezifisch. Tierorgane sind reich an RNase, insbesondere in der Bauchspeicheldrüse.

Klassifikation

Ribonuklease kann hauptsächlich in Endoribonukleasen und Exoribonukleasen unterteilt werden. Ähnlich wie Restriktionsenzyme, die hochspezifische Sequenzen von doppelsträngiger DNA spalten, wurde eine Vielzahl von Endoribonukleasen, die spezifische Sequenzen von einzelsträngiger RNA erkennen und spalten, kürzlich klassifiziert, darunter RNase A, RNase H, RNase III, RNase L, RNase P, RNase PhyM, RNase T1, RNase T2, RNase U2 und RNase V. RNase A ist eines der ersten Enzyme, das in großen Mengen in gereinigter, kristalliner Form gewonnen wurde und ist überwiegend robust in der allgemeinen Laboranwendung. Hier wird es normalerweise isoliert, indem ein grober Zellextrakt gekocht wird, bis alle Enzyme außer RNase A denaturiert sind. RNase A hat eine Spezifität für einzelsträngige RNAs und spaltet das 3'-Ende von ungepaarten C- und U-Resten, wodurch schließlich ein 3'-phosphoryliertes Produkt über ein 2',3'-zyklisches Monophosphat-Intermediat ohne die Notwendigkeit von Cofaktoren erzeugt wird. RNase H ist ebenfalls eine häufig verwendete Endonuklease und katalysiert die Spaltung von RNA über einen hydrolytischen Mechanismus, um ein 5'-phosphoryliertes Produkt zu hinterlassen, was durch ein enzymgebundenes zweiwertiges Metallion unterstützt wird. Die Haupttypen von Exoribonukleasen bestehen aus Polynukleotid-Phosphorylase (PNPase), RNase PH, RNase R, RNase D, RNase T, Oligoribonuklease, Exoribonuklease I und Exoribonuklease II, wobei PNPase und RNase PH auch als Nucleotidyltransferase fungieren. RNase R, ein naher Verwandter von RNase II, kann RNA mit sekundären Strukturen ohne die Hilfe von Zubehörfaktoren abbauen.

Abbildung 1. Transphosphorylierungs- und Hydrolysereaktionen, die von RNase A katalysiert werden. (Cuchillo C M; et al. 2011)

Funktion

Fast alle untersuchten Organismen enthalten zwei verschiedene Arten von RNasen, was darauf hinweist, dass der Abbau von RNA ein sehr alter und wichtiger Prozess ist. RNasen spielen eine wichtige Rolle in vielen biologischen Prozessen, wie Angiogenese und Selbstinkompatibilität bei blühenden Pflanzen. Viele Stressreaktionstoxine in prokaryotischen Toxin-Antitoxin-Systemen haben gezeigt, dass sie RNase-Aktivität und Homologie aufweisen. RNasen spielen entscheidende Rollen bei der Reifung sowohl von mRNAs, die genetisches Material zur Herstellung von Proteinen tragen, als auch von nicht-kodierenden RNAs, die in verschiedenen zellulären Prozessen fungieren. RNasen könnten auch zelluläre RNA reinigen, die nicht mehr benötigt wird. Darüber hinaus bieten aktive RNA-Abbausysteme als erste Verteidigung gegen RNA-Viren die zugrunde liegende Maschinerie für fortgeschrittenere zelluläre Immunstrategien wie RNAi. RNasen sind extrem häufig und führen normalerweise zu sehr kurzen Lebensdauern für jede RNA, die sich nicht in einer geschützten Umgebung befindet, da einige Zellen große Mengen unspezifischer RNasen wie RNase A und RNase T1 sekretieren. Es ist bemerkenswert, dass alle intrazellulären RNAs durch viele Strategien vor RNase-Aktivität geschützt sind, einschließlich 5'-End-Capping, 3'-End-Polyadenylierung sowie Faltung innerhalb eines RNA-Protein-Komplexes. Eine weitere Schutzmethode ist die Anwendung von RNase-Inhibitoren, die einen relativ großen Anteil an zellulärem Protein in einigen Zelltypen enthalten und an bestimmte RNasen mit der höchsten Affinität aller Protein-Protein-Interaktionen binden können. Die Dissoziationskonstante für den RNase-Inhibitor-RNase A-Komplex beträgt unter physiologischen Bedingungen etwa 20 fM. Die meisten Labore nutzen RNase-Inhibitoren, um ihre Proben vor dem Abbau durch Umwelt-RNasen zu schützen.

RNase-Kontamination

Die Extraktion von RNA in molekularbiologischen Experimenten ist aufgrund der Existenz ubiquitärer und robuster RNasen, die RNA-Proben abbauen könnten, äußerst kompliziert. Bestimmte RNasen sind extrem robust und ihre Inaktivierung ist im Vergleich zur Neutralisierung von DNasen ziemlich schwierig. Abgesehen von den zellulär freigesetzten RNasen gibt es mehrere RNasen in der Umwelt. RNasen haben sich entwickelt, um viele extrazelluläre Funktionen in verschiedenen Organismen zu zeigen. Zum Beispiel ist RNase 7, die von der menschlichen Haut sekretierte wird, ein Mitglied der RNase A-Superfamilie und könnte als Verteidigung gegen potente Antipathogene fungieren. Die enzymatische RNase-Aktivität dieser sekretieren RNasen ist möglicherweise nicht einmal notwendig für ihre neue, erweiterte Funktion.

Inaktivierung von RNase

RNase ist sehr stabil und kann unter extremen Bedingungen vorübergehend deaktiviert werden, kann jedoch nach der Entfernung des Einschränkungsfaktors schnell reaktiviert werden. Weder die konventionelle Hochtemperatur- und Hochdruck-Dampfsterilisation noch Proteininhibitoren können die Aktivität von RNase vollständig deaktivieren. Es ist weit verbreitet in der menschlichen Haut, daher müssen bei molekularbiologischen Experimenten, die mit der Vorbereitung von RNA zu tun haben, Handschuhe getragen werden. Unter normalen Umständen wird die innere und äußere Oberfläche des Flüssigkeitsdispensers mit 70% Ethanol, das von DEPC vorbereitet wurde, gereinigt, um die Anforderungen im Wesentlichen zu erfüllen. Glaswaren werden normalerweise 3 Stunden lang in einem 140 Grad heißen Ofen gebacken.

Referenz