RNase

Ribonuklease, üblicherweise als RNase abgekürzt, ist eine Nuklease, die den Abbau von RNA in kleinere Bestandteile katalysiert. RNasen lassen sich grundsätzlich in Endoribonukleasen und Exoribonukleasen einteilen und umfassen mehrere Unterklassen innerhalb der Enzymklassen EC 2.7 (phosphorolytische Enzyme) und 3.1 (hydrolytische Enzyme). Das aktive Zentrum von RNasen ähnelt einem Graben- bzw. Rift-Tal, wobei die katalytisch relevanten Seitenketten die Wände und den Boden dieser „Mulde“ bilden. Kleine Substrate passen exakt in die Mitte des aktiven Zentrums und ermöglichen dadurch eine optimale Interaktion mit den Aminosäureresten. Tatsächlich weist die Bindetasche eine leichte Krümmung auf, die sich auch im Substrat widerspiegelt. Dennoch sind die meisten Exoribonukleasen und Endoribonukleasen in der Regel nicht sequenzspezifisch. Tierische Organe sind reich an RNase, insbesondere das Pankreas.

Klassifizierung

Ribonukleasen lassen sich im Wesentlichen in Endoribonukleasen und Exoribonukleasen gruppieren. Analog zu Restriktionsenzymen, die hochspezifische Sequenzen doppelsträngiger DNA schneiden, wurden in jüngerer Zeit verschiedene Endoribonukleasen klassifiziert, die spezifische Sequenzen einzelsträngiger RNA erkennen und spalten; hierzu zählen RNase A, RNase H, RNase III, RNase L, RNase P, RNase PhyM, RNase T1, RNase T2, RNase U2 und RNase V. RNase A gehört zu den ersten Enzymen, die in großen Mengen in gereinigter, kristalliner Form gewonnen wurden, und ist im routinemäßigen Laborgebrauch besonders robust. In diesem Zusammenhang wird sie üblicherweise isoliert, indem ein roher Zellysat-Extrakt aufgekocht wird, bis alle Enzyme außer RNase A denaturiert sind. RNase A ist spezifisch für einzelsträngige RNAs und spaltet am 3'-Ende ungepaarter C- und U-Reste; dabei entsteht über ein 2',3'-zyklisches Monophosphat-Zwischenprodukt ein 3'-phosphoryliertes Produkt, ohne dass Kofaktoren erforderlich sind. RNase H ist ebenfalls eine häufig verwendete Endonuklease und katalysiert die Spaltung von RNA über einen hydrolytischen Mechanismus unter Bildung eines 5'-phosphorylierten Produkts; unterstützt wird dies durch ein enzymgebundenes zweiwertiges Metallion. Zu den wichtigsten Exoribonukleasen zählen u. a. Polynukleotid-Phosphorylase (PNPase), RNase PH, RNase R, RNase D, RNase T, Oligoribonuklease, Exoribonuklease I und Exoribonuklease II; dabei fungieren PNPase und RNase PH zusätzlich als Nukleotidyltransferasen. RNase R als naher Homolog von RNase II kann RNA mit Sekundärstrukturen auch ohne Hilfsfaktoren abbauen.

Abbildung 1. Von RNase A katalysierte Transphosphorylierungs- und Hydrolysereaktionen. (Cuchillo C M; et al. 2011)

Funktion

Nahezu alle untersuchten Organismen enthalten zwei unterschiedliche Arten von RNasen, was darauf hindeutet, dass der Abbau von RNA ein sehr alter und bedeutender Prozess ist. RNasen nehmen eine wichtige Stellung in zahlreichen biologischen Prozessen ein, etwa in der Angiogenese und der Selbstinkompatibilität bei Blütenpflanzen. Für viele Stressantwort-Toxine in prokaryotischen Toxin-Antitoxin-Systemen wurde RNase-Aktivität sowie Homologie nachgewiesen. RNasen spielen eine Schlüsselrolle bei der Reifung sowohl von mRNAs, die die genetische Information für die Proteinsynthese tragen, als auch von nicht-kodierenden RNAs, die in vielfältigen zellulären Prozessen wirken. RNasen können zudem zelluläre RNA entfernen, die nicht mehr benötigt wird. Darüber hinaus stellen aktive RNA-Abbausysteme eine erste Verteidigungslinie gegen RNA-Viren dar und liefern die Grundlage für weiterentwickelte zelluläre Immunstrategien wie RNAi. RNasen sind äußerst verbreitet und führen in der Regel zu sehr kurzen Halbwertszeiten ungeschützter RNA, da einige Zellen große Mengen unspezifischer RNasen wie RNase A und RNase T1 sezernieren. Hervorzuheben ist, dass alle intrazellulären RNAs durch verschiedene Strategien vor RNase-Aktivität geschützt werden, darunter 5'-End-Capping, 3'-End-Polyadenylierung sowie die Faltung innerhalb von Ribonukleoprotein-Komplexen. Eine weitere Schutzmaßnahme ist der Einsatz von RNase-Inhibitoren, die in einigen Zelltypen einen relativ großen Anteil des zellulären Proteins ausmachen und bestimmte RNasen mit der höchsten Affinität binden können, die für Protein-Protein-Interaktionen bekannt ist. Die Dissoziationskonstante für den RNase-Inhibitor–RNase-A-Komplex beträgt unter physiologischen Bedingungen etwa 20 fM. Die meisten Labore verwenden RNase-Inhibitoren, um Proben vor dem Abbau durch RNasen aus der Umgebung zu schützen.

RNase-Kontamination

Die Extraktion von RNA in molekularbiologischen Experimenten ist aufgrund der allgegenwärtigen und robusten RNasen, die RNA-Proben abbauen können, besonders anspruchsvoll. Bestimmte RNasen sind extrem stabil, und ihre Inaktivierung ist im Vergleich zur Neutralisierung von DNasen deutlich schwieriger. Neben zellulär freigesetzten RNasen sind auch in der Umgebung verschiedene RNasen vorhanden. RNasen haben sich in vielen Organismen so entwickelt, dass sie zahlreiche extrazelluläre Funktionen erfüllen. So ist beispielsweise RNase 7, die von der menschlichen Haut sezerniert wird, ein Mitglied der RNase-A-Superfamilie und kann als Abwehr gegen potente Pathogene wirken. Die enzymatische RNase-Aktivität dieser sezernierten RNasen ist für ihre neue, erweiterte Funktion möglicherweise nicht einmal erforderlich.

Inaktivierung von RNase

RNase ist sehr stabil und kann unter bestimmten Extrembedingungen vorübergehend deaktiviert werden, wird jedoch nach Entfernung des limitierenden Faktors rasch reaktiviert. Weder konventionelle Dampfsterilisation bei hoher Temperatur und hohem Druck noch Protein-Inhibitoren können die RNase-Aktivität vollständig eliminieren. Da RNasen auf der menschlichen Haut weit verbreitet sind, müssen bei molekularbiologischen Arbeiten im Zusammenhang mit der RNA-Präparation Handschuhe getragen werden. Unter normalen Bedingungen werden die Innen- und Außenflächen von Flüssigkeitsspendern mit 70%igem, mit DEPC hergestelltem Ethanol abgewischt, um die Anforderungen grundsätzlich zu erfüllen. Glaswaren werden üblicherweise 3 Stunden lang bei 140 °C im Ofen ausgeheizt.

Literatur