RT

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Einführung

1970 war ein tumultuöses Jahr auf den Campus der Vereinigten Staaten. Zur gleichen Zeit fanden Experimente statt, die einen dramatischen Einfluss auf das embryonale Feld der eukaryotischen Molekularbiologie haben sollten, in den Laboren von David Baltimore am MIT und Howard Temin an der UW. Sie berichteten auch über die RNA-abhängige DNA-Polymerase (bald umbenannt in Reverse Transkriptase, RT), eine Entdeckung, die später die Forschung zur viralen Replikation, der genetischen Grundlage von Krebs und den Mechanismen der eukaryotischen Genexpression beeinflusste und ein unverzichtbares Werkzeug für die Entwicklung der Biotechnologie bereitstellte, die zu dieser Zeit noch relativ rückständig war. Bemerkenswerterweise führte die Entdeckung von RT zu erheblichen Mitteln für die Krebsforschung, insbesondere in der Virologie, was den Weg für die Entdeckung neuer wichtiger menschlicher Krankheitserreger ebnete, wie die humanen T-Zell-Leukämie-Viren (HTLVs) und das humane Immunschwächevirus (HIV).

Abbildung 1. Strukturen von repräsentativen Reverse Transkriptasen (RTs) (Martín-Alonso, S.; et al. 2020)

Geschichte der Retroviren

Avian Leukose (eigentlich Leukämie) wurde 1907 entdeckt, die ersten malignen Tumoren, die durch filtrierte Extrakte übertragbar waren (d.h. Viren). Peyton Rous erhielt 1911 den Nobelpreis für seine Arbeit zur Entdeckung des Rous-Sarkom-Virus (RSV). Andere Viren, die Ende des 19. und Anfang des 20. Jahrhunderts entdeckt wurden und mit anderen Krankheiten in Verbindung standen – einschließlich neurologischer Störungen, Immunschwäche, Abmagerung und Anämie – stellten sich ebenfalls als Retroviren heraus. Die experimentellen Möglichkeiten waren zu dieser Zeit begrenzt, aber frühe Tierversuche lieferten wichtige Beobachtungen, wie die Visualisierung von Viruspartikeln durch Elektronenmikroskopie.

Die Unterschiede zwischen den beiden Arten von RNA-Tumorviren (wie sie damals genannt wurden) wurden allmählich entdeckt. Das erste wird jetzt als akutes transformierendes Virus bezeichnet, vertreten durch das avian und murine Sarkomvirus. Diese Viren lösen Tumorbildung in relativ kurzer Zeit aus und töten den Wirt normalerweise nach einer Woche oder zwei. Das andere, als nicht-akutes Virus bezeichnet, benötigt länger, um eine Krankheit zu verursachen, normalerweise Leukämie oder Lymphom.

Die 1950er und 1960er Jahre waren das goldene Zeitalter der Molekularbiologie, in dem die Doppelhelixstruktur der DNA entdeckt und viele extrem einfache, aber leistungsstarke Methoden entwickelt wurden. Kombiniert mit den Werkzeugen der Nukleinsäurechemie bieten diese Methoden ein grundlegendes Verständnis der Genstruktur, ihrer regulatorischen Mechanismen und der Mittel, durch die genetische Informationen ausgedrückt werden. Fast alle diese Entdeckungen resultierten aus Studien an Bakterien und führten zum zentralen Dogma der Molekularbiologie – dass die genetischen Informationen einer Zelle in Form von DNA kodiert und gespeichert sind und irreversibel zu RNA und dann zu Proteinen fließen. Zweitens war die grundlegende Einheit der Biologie, „was für E. coli wahr ist, ist auch für den Elefanten wahr“, das Mantra zu dieser Zeit. Aber beide dieser Überzeugungen, die damals gehalten wurden, änderten sich plötzlich Mitte der 1970er Jahre.

Reverse Transkriptase bei der Entdeckung von Onkogenen

Die retrovirale RT spielt eine wichtige Rolle bei der Entdeckung von Onkogenen. Die Anwesenheit von RT in Virionen kann genutzt werden, um molekulare Sonden von virusbezogenen Sequenzen herzustellen, die nützlich sind, um die virale Replikation zu überwachen. In RT-Reaktionen (Replikation von nativer viraler RNA in Virionen oder Kopieren von mRNA mit gereinigter RT) stört Actinomycin D die DNA-Synthese von RNA-Vorlagen nicht, verhindert jedoch die DNA-Replikation. Daher ist in Anwesenheit von Actinomycin D das resultierende Produkt einzelsträngige DNA, die komplementär zur Vorlage RNA ist; wenn Actinomycin D abwesend ist, ist das Endprodukt doppelsträngige DNA. Sonden, die auf diese Weise hergestellt wurden, wurden Tage vor der molekularen Klonierung verwendet, um den zellulären Ursprung von viralen Onkogenen zu entdecken.

Reverse Transkriptase und Telomerase

Francis Crick schrieb zu dieser Zeit eine Übersicht, in der er feststellte, dass die Aktivitäten von RT nicht wirklich unvereinbar mit dem zentralen Dogma waren. RT wurde zunächst als ein virales Enzym angesehen, das einzigartig für Retroviren und Pararetroviren ist, und später wurde festgestellt, dass die umgekehrte Transkription die Grundlage der zellulären Telomerase ist. Telomerase ist ein Multiproteinkomplex, der für die Erhaltung der Chromosomenenden (Telomere) verantwortlich ist, indem er tandemartige Kopien von Hexanukleotid-Wiederholungen produziert. Die Schlüsselfaktoren der Telomerase sind die telomerase reverse Transkriptase (TERT) und die telomerase RNA. Telomerase erzeugt telomerische Wiederholungen, indem sie den Folgestrang der telomerischen DNA jeweils um 6 nt zyklisch verlängert, und TERT verwendet die telomerase RNA als Vorlage. Daher sind grundlegende Prozesse in Zellen alle mit der Verwendung von RT verbunden. Es ist möglich, dass zelluläre RTs ursprünglich von viralen RTs abgeleitet wurden und umgekehrt.