Enzymaktivitätsmessung für RNA-gesteuerte DNA-Polymerase

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RNA-gesteuerte DNA-Polymerasen (EC 2.7.7.49; Reverse-Transkriptasen; RTs) stammen hauptsächlich von Retroviren, wie dem aviären Myeloblastosevirus (AMV) oder dem Moloney-Mausleukämievirus (MMLV), die die Enzyme verwenden, um komplementäre DNA (cDNA) aus ihren RNA-Vorlagen zu erzeugen, ein Prozess, der als Reverse Transkription bezeichnet wird. Allerdings verwenden auch Nicht-Retroviren RTs, wie das Hepatitis-B-Virus (HBV). AMV- und MMLV-RTs sind multifunktionale Enzyme, werden jedoch hauptsächlich als RNA-gesteuerte DNA-Polymerasen eingesetzt. Insbesondere werden Oligodeoxynukleotide – entweder Oligopolymere oder eine Sammlung von kurzen, spezifischen oder zufälligen DNA-Sequenzen – als Primer für die Verlängerung auf RNA-Vorlagen verwendet. Die aus der RNA-Vorlage synthetisierte DNA wird als komplementäre DNA (cDNA) bezeichnet. Darüber hinaus haben RTs auch eine DNA-gesteuerte DNA-Polymeraseaktivität (Abbildung 1), obwohl die Einfügung von dNTPs sehr langsam ist, etwa 5 Nukleotide pro Sekunde. Außerdem fehlt der DNA-Polymeraseaktivität der Reverse-Transkriptase eine 3’→5’ Exonukleaseaktivität, was für bestimmte Anwendungen von Vorteil sein kann. Darüber hinaus degradiert die dritte Aktivität der RTs die RNA in einem RNA:DNA-Hybrid (Abbildung 2). Funktionell dient die RNase H-Aktivität als nützlicher Teil des Lebenszyklus des Retrovirus, kann jedoch auch selektiv Teile eines RNA-Moleküls zerstören, an die DNA-Moleküle hybridisiert wurden.

Abbildung 1: Die Reverse-Transkriptase zeigt 5’→3’ DNA-Polymeraseaktivität (DNA-gesteuerte DNA-Polymeraseaktivität).
Referenz: Tzertzinis G, Tabor S, Nichols N M. Current Protocols in Molecular Biology, 2008: 3.7. 1-3.7. 4.

Abbildung 2: Die Reverse-Transkriptase zeigt auch 5’→3’ und 3’→5’ Exoribonukleaseaktivität (RNase H-Aktivität).
Referenz: Tzertzinis G, Tabor S, Nichols N M. Current Protocols in Molecular Biology, 2008: 3.7. 1-3.7. 4.

RTs spielen eine entscheidende Rolle in der biologischen Analyse, der Arzneimittelentwicklung und der antiviralen Therapie. Zum Beispiel werden RTs häufig in der Forschung verwendet, um die Polymerase-Kettenreaktionstechnik auf RNA in einer Technik namens Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) anzuwenden. Darüber hinaus dienen HIV-1 RTs als die Hauptziele der antiviralen Therapie. Es wurde auch berichtet, dass RTs mit der Krebsbehandlung in Verbindung stehen.

Diese oben genannten Funktionen verdeutlichen die Unentbehrlichkeit und Bedeutung von RT-Aktivitätsassays als Werkzeuge zur Quantifizierung und Charakterisierung verschiedener Retroviren. Creative Enzymes ist vollständig qualifiziert, die zuverlässigsten Aktivitätsassays für RTs bereitzustellen. Der kolorimetrische RT-Assay ist für den Einsatz in Forschungsstudien konzipiert, als Methode zur quantitativen Bestimmung der RT-Aktivität in Zellkulturen und anderen biologischen Proben. Der Assay hat sich als nützlich erwiesen, um die RT-Aktivität von verschiedenen Retroviren wie HIV-1, HIV-2, AMV und MMLV zu bestimmen. Creative Enzymes freut sich, die Einzelheiten Ihres Bedarfs an Aktivitätsassays von RTs zu erfahren und wird die ordnungsgemäße Durchführung der Tests sicherstellen.

Abbildung 3: Die Kristallstruktur der RT des humanen Immundefizienzvirus Typ 1.
PDB: 1HMV