Messung der Enzymaktivität von Galaktokinase

Nach jahrelanger Entwicklung und Forschung zählt Creative Enzymes zu den weltweit führenden Anbietern von Enzym-Assays. Als zentraler Bestandteil unserer Unternehmensphilosophie sind wir fest davon überzeugt, dass die Servicequalität die grundlegende Voraussetzung für unseren nachhaltigen Erfolg ist. Creative Enzymes ist mit demselben unternehmerischen und innovativen Geist weiter gewachsen und verbindet Natur und Wissenschaft. Ausgestattet mit modernsten spektrophotometrischen Instrumenten bieten wir den Aktivitätsassay für Galactokinase professionell und termingerecht an.

In den meisten Organismen erfolgt die Umwandlung von β-D-Galactose in das metabolisch besser verwertbare Glucose-1-phosphat durch die Wirkung von vier Enzymen, die zusammen den Leloir-Stoffwechselweg bilden. Galactokinase (EC 2.7.1.6; ATP:alpha-D-galactose-1-phosphotransferase) katalysiert den zweiten Schritt dieses Weges, nämlich die Umwandlung von α-D-Galactose zu Galactose-1-phosphat, wie in Abbildung 1 dargestellt. Galactokinase steht seit vielen Jahren im Fokus der Forschung, da sie eine wichtige Rolle im Zuckerstoffwechsel und in der Zuckerumwandlung spielt. So führen Defekte dieses Enzyms beim Menschen zu dem Krankheitsbild, das als Galaktosämie bezeichnet wird. Zudem wurde sie in jüngster Zeit mittels gerichteter Evolution zur Synthese neuer natürlicher und nicht-natürlicher Zucker-1-phosphate weiterentwickelt. Darüber hinaus können galactokinaseähnliche Moleküle als Sensoren für die intrazelluläre Galactosekonzentration dienen und unter geeigneten Bedingungen als transkriptionelle Regulatoren fungieren.

Abbildung 1: Der Leloir-Stoffwechselweg. Die enzymatischen Schritte, die an der Umwandlung von b-D-Galactose-1-phosphat beteiligt sind.
Referenz: Holden H M, et al. Cellular & Molecular Life Sciences Cmls, 2004, 61(19-20):2471-2484.

Galactokinasen aus verschiedenen Organismen, darunter Mensch, Hefe, Pflanzen und Bakterien, wurden isoliert, exprimiert und charakterisiert. Diese Enzyme weisen unterschiedliche spezifische Aktivitäten auf. Beispielsweise ist die Galactokinase aus Saccharomyces cerevisiae (ScGalK) mehr als 150‑mal effizienter als die Galactokinase aus Escherichia coli (EcGalK). Darüber hinaus zeigten Untersuchungen zur Substratspezifität, dass Galactokinase Modifikationen der Galactose (Gal) an C‑2 und C‑6 tolerieren kann. So sind neben Gal auch 2‑Desoxygalactose (Gal2D) und 6‑Desoxygalactose (Gal6D, auch als D‑Fucose bekannt) mögliche Substrate von EcGalK und ScGalK. Zu beachten ist, dass Galactokinasen aus Säugetieren und aus E. coli keine Aktivität gegenüber N‑Acetyl‑alpha‑D‑galactosamin aufweisen. Vermutlich aufgrund der Substratdiversität sind spektrophotometrische Aktivitätsassays für Galactokinase im industriellen Maßstab bislang nicht umfassend etabliert, obwohl Aktivitätsmessungen mit anderen Methoden bereits berichtet wurden. Creative Enzymes verfügt über die erforderliche Expertise, um den präzisesten enzymatischen Assay für Galactokinase mittels spektrophotometrischer Verfahren bereitzustellen. Die Aktivität der Galactokinase wurde spektrophotometrisch mittels eines gekoppelten Assays bestimmt. Die Umsetzungsrate von alpha‑D‑Galactose zu alpha‑D‑Galactose‑1‑phosphat wurde durch Kopplung der Reaktion an die Bildung von Lactat aus Pyruvat in Anwesenheit von NADH überwacht. Somit wurde die Aktivität der Galactokinase bei 340 nm durch Messung der Bildung von NADH bestimmt.

Creative Enzymes ist ein führendes Unternehmen für hochwertige bioanalytische Dienstleistungen und Auftragsforschung mit Spezialisierung auf enzymatische Analytik und bedient die Anforderungen unserer Kunden weltweit. Die Qualität unserer Produkte wird durch zahlreiche herausragende Wissenschaftler sichergestellt, die sich der Prüfung und Optimierung von Methoden für enzymatische Assays widmen. Insgesamt ist Creative Enzymes Ihre beste Wahl bei der Entwicklung von Produkten, die Galactokinase enthalten.

Abbildung 2: Die Kristallstruktur der Galactokinase aus S. cerevisiae.
PDB: 2AJ4