TdT

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TdT (EC 2.7.7.31, terminale Desoxynukleotidyltransferase) gehört zur Pol‑X‑Familie der DNA‑Polymerasen. TdT ist die erste in Säugetieren identifizierte DNA‑Polymerase und wurde 1960 aus Kalbsthymus-Extrakt gereinigt. Die anerkannte Bezeichnung dieses Enzyms lautet DNA‑Nukleotidylexotransferase. Weitere gebräuchliche Namen sind u. a. Terminal-Addition-Enzym, terminale Desoxynukleotidyltransferase, terminale Desoxyribonukleotidyltransferase und terminale Transferase. TdT verwendet ausschließlich einzelsträngige DNA als Nukleinsäuresubstrat und inkorporiert Nukleotide template‑unabhängig zur Vervollständigung der DNA‑Synthese. Im Rahmen der V(D)J‑Rekombination fügt TdT einzelsträngiger DNA zufällig Nukleinsäuren hinzu. Durch diese fein abgestimmte Randomisierung genetischen Materials spielt TdT eine wichtige Rolle bei Evolution und Anpassung des Immunsystems der Wirbeltiere. Die Fähigkeit von TdT zur zufälligen Nukleotidinkorporation trägt zur Bildung unterschiedlicher Immunglobulin- und T‑Zell‑Antigenrezeptoren bei und erhöht damit die Diversität der Antigenrezeptoren.

Struktur

Die Struktur von TdT ähnelt der aller DNA‑Polymerasen der X‑Familie und weist am C‑Terminus eine Polβ‑ähnliche Domäne auf, einschließlich Daumen‑, Finger‑, Handflächen‑ (Palm‑) und 8‑kDa‑Domäne. TdT besitzt zudem eine „Lasso‑ähnliche“ Schleife, die eine Interaktion zwischen Enzym und Matrizenstrang verhindert. Darüber hinaus steht die 8‑kDa‑Domäne, auch als Zeigefinger‑Domäne bezeichnet, mit der Daumen‑Domäne in Kontakt und bildet eine Kavität, die die Diffusion von dNTPs zum aktiven Zentrum des Enzyms ermöglicht. Dieses Merkmal definiert die allgemeine Form von TdT als Ringstruktur, in der der Primer senkrecht zur Achse der Kavität auf der Palm‑Domäne ausgerichtet ist. Zusätzlich zur Polβ‑ähnlichen Domäne umfasst der N‑Terminus von TdT ein Kernlokalisationssignal‑Motiv (NLS) sowie die C‑terminale BRCT‑Domäne (BRCA1 C‑terminal). Die BRCT‑Domäne vermittelt Protein/Protein‑ und Protein/DNA‑Interaktionen im DNA‑Reparaturweg sowie in der Regulation von Zellzyklus‑Checkpoints nach DNA‑Schädigung. Die BRCT‑Domäne in TdT interagiert mit Ku70/86, einem Protein‑Heterodimer, das freie DNA‑Enden während der V(D)J‑Rekombination und der Reparatur von Doppelstrangbrüchen erkennt und bindet.

Abbildung 1. Domänenorganisation von DNA‑Polymerasen der X‑Familie. (Fowler J.D. 2006)

Abbildung 2. Struktur der Polβ‑ähnlichen Domäne. (Fowler J.D. 2006)

Katalytischer Mechanismus

Ein auffälliges Merkmal der DNA‑Polymerasen der X‑Familie ist, dass das katalytische Zentrum hoch konserviert ist: Drei strikt konservierte Aspartate koordinieren zwei essenzielle Metallionen, die am Zwei‑Metallionen‑Mechanismus beteiligt sind. Metall A aktiviert die 3'-OH‑Gruppe des letzten Nukleotids, sodass der Angriff auf das α‑Phosphat erfolgen kann, während Metall B zusammen mit dem Nukleosidtriphosphat eintritt, um die abgehende Gruppe (PPi) zu stabilisieren. Bei TdT wurde die Koordinationsgeometrie zweiwertiger Metallionen, einschließlich Übergangsmetallionen wie Mn⁺⁺, Co⁺⁺ und Zn⁺⁺, im vollständig ausgebildeten katalytischen Zentrum auf atomarer Ebene untersucht; ihre Aktivität als Nukleotidyltransferase ist dabei effizienter als die von Mg⁺⁺. Um den neu verlängerten Primerstrang für eine weitere Addition in das katalytische Zentrum zu translozieren, muss Metall A austreten und durch Na⁺ ersetzt werden.

Abbildung 3. Mechanismus von TdT, gebunden an eine DNA‑Synapse. (Loc’h J. 2018)

TdT kann zufällige Desoxyribonukleotide (dNTPs) template‑unabhängig an ssDNA‑Primer anfügen, wobei Primer eine Mindestlänge von 3 Nukleotiden aufweisen müssen. In‑vitro‑Experimente haben gezeigt, dass TdT alle vier natürlichen dNTPs nutzen kann, jedoch dCTP und dGTP gegenüber dATP und dTTP bevorzugt inkorporiert. Darüber hinaus kann die Nukleotid‑Bindungsstelle von TdT sowohl Desoxyribonukleotide als auch Ribonukleosidtriphosphate (dNTPs und rNTPs) aufnehmen.

Anwendung

TdT kann als Anti‑Krebs‑Target eingesetzt werden. Klinische Evidenz deutet darauf hin, dass Veränderungen der TdT‑Aktivität und der Expressionsniveaus eine wichtige Rolle bei Krebsentstehung, Progression und dem Ansprechen auf Chemotherapie spielen. Bei der akuten lymphoblastischen Leukämie (ALL) der B‑Zell‑ und T‑Zell‑Linie sowie bei der akuten myeloischen Leukämie (AML) ist die TdT‑Expression erhöht; hohe TdT‑Aktivitätsniveaus sind mit einer ungünstigen Prognose assoziiert. Studien haben gezeigt, dass TdT‑positive Patientinnen und Patienten im Vergleich zu TdT‑negativen Leukämiepatienten eine um den Faktor zwei reduzierte Remissionsrate aufweisen. Diese Befunde haben die Forschung an selektiven TdT‑Inhibitoren vorangetrieben, die als chemotherapeutische Wirkstoffe gegen diese Leukämieformen eingesetzt werden.

TdT kann als biochemisches Werkzeug verwendet werden. TdT kann eine Vielzahl von Nukleotid‑Analoga nutzen und toleriert zahlreiche Modifikationen von Nukleotiden, was eine effiziente Methode zur Markierung von Doppelstrang‑DNA‑Brüchen in vivo und in vitro ermöglicht. TUNT (TdT‑mediated dUTP‑biotin nick end‑labeling) ist eine TdT‑basierte Technologie, die biotinyliertes dUMP effizient an das 3'-Ende einzelsträngiger DNA an der Bruchstelle inkorporiert. Das gebundene Biotin‑dUMP kann mittels Fluoreszenzmarkierung detektiert werden und ermöglicht die direkte Quantifizierung von Anzahl und Lokalisation von DNA‑Brüchen. Diese Technik wird häufig zum Nachweis von Apoptose und programmierter Zellnekrose in eukaryotischen Zellen eingesetzt. TdT kann außerdem als Biokatalysator verwendet werden, um das 3'-Ende eines synthetischen Oligonukleotids mit einem Radionukleotid oder einer Fluoreszenzsonde zu markieren. Diese markierten Primer werden an einen komplementären Strang hybridisiert und können als radioaktives Substrat zum Nachweis der Aktivität eines Enzyms im Nukleinsäurestoffwechsel dienen.

Literatur

1. Fowler, J.D., Suo, Z. Biochemical, structural, and physiological characterization of terminal deoxynucleotidyl transferase. Chem. Rev, 2006, 106:2092−2110.
2. Loc’h, J., Delarue, M. Terminal deoxynucleotidyltransferase: the story of an untemplated DNA polymerase capable of DNA bridging and templated synthesis across strands. Curr Opin Struct Biol, 2018, 53:22-31.
3. Motea, E.A., Berdis, A.J. Terminal deoxynucleotidyl transferase: the story of a misguided DNA polymerase. Biochim Biophys Acta, 2010, 1804(5): 1151–1166.