TdT

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TdT (EC 2.7.7.31, Terminal Deoxynucleotidyl Transferase) gehört zur pol X-Familie der DNA Polymerasen. TdT ist die erste DNA-Polymerase, die bei Säugetieren identifiziert und 1960 aus Kalbthymus-Extrakt isoliert wurde. Der akzeptierte Name dieses Enzyms ist DNA Nucleotidylexotransferase. Weitere gebräuchliche Namen sind terminale Addition Enzym, terminale Deoxynucleotidyltransferase, terminale Deoxyribonucleotidyltransferase und terminale Transferase. TdT verwendet nur einzelsträngige DNA als Nukleinsäure-Substrat und integriert Nukleotide auf eine vorlagenunabhängige Weise, um die DNA-Synthese abzuschließen. Bei der V(D)J-Rekombination fügt TdT zufällig Nukleinsäuren zu einzelsträngiger DNA hinzu. Durch die feine Randomisierung des genetischen Materials spielt TdT eine wichtige Rolle in der Evolution und Anpassung des Wirbeltier-Immunsystems. Die Fähigkeit von TdT, Nukleotide zufällig zu integrieren, trägt zur Produktion unterschiedlicher Immunglobuline und T-Zell-Antigenrezeptoren bei und erhöht die Vielfalt der Antigenrezeptoren.

Struktur

Die Struktur von TdT ähnelt der aller X-Familie DNA-Polymerasen, mit einer Polβ-ähnlichen Domäne am C-Terminus, einschließlich Daumen-, Finger-, Handfläche- und 8 kDa-Domänen. TdT hat auch eine "lariat-ähnliche" Schleife, die die Interaktion zwischen dem Enzym und dem Vorlage-Strang verhindert. Darüber hinaus kontaktiert die 8kDa-Domäne, auch bekannt als Zeigefinger-Domäne, die Daumen-Domäne, um eine Höhle zu bilden, die es dNTPs ermöglicht, zum aktiven Zentrum des Enzyms zu diffundieren. Dieses Merkmal definiert die allgemeine Form von TdT als Ringstruktur, in der der Primer senkrecht zur Achse der Höhle auf der Handflächendomäne steht. Neben der Polβ-ähnlichen Domäne enthält das N-Terminus von TdT auch ein nukleares Lokalisierungssignal (NLS) Motiv und das BRCA1 C-terminale (BRCT). Die BRCT-Domäne vermittelt Protein/Protein- und Protein/DNA-Interaktionen im DNA-Reparaturweg und der Regulation des Zellzyklus-Checkpoints nach DNA-Schäden. Die BRCT-Domäne in TdT interagiert mit Ku70/86, einem Protein-Heterodimer, das freie DNA-Enden während der V(D)J-Rekombination und der Reparatur von Doppelstrangbrüchen erkennt und bindet.

Abbildung 1. Domänenorganisation der X-Familie DNA-Polymerasen. (Fowler J.D. 2006)

Abbildung 2. Struktur der Polβ-ähnlichen Domäne. (Fowler J.D. 2006)

Katalytischer Mechanismus

Eine auffällige Eigenschaft der X-Familie DNA-Polymerasen ist, dass die katalytische Stelle hochgradig konserviert ist, mit drei streng konservierten Aspartaten, die zwei essentielle Metallionen koordinieren, die am Zwei-Metall-Ionen-Mechanismus teilnehmen. Metall A aktiviert die 3'OH-Gruppe des letzten Nukleotids, um den Angriff des α-Phosphats zu ermöglichen, während Metall B eintritt, um die stabile Abgangsgruppe (PPi) zusammen mit dem Nukleosidtriphosphat zu bilden. In TdT wird die Koordinationsgeometrie der zweiwertigen Metallionen, einschließlich Übergangsmetallionen wie Mn⁺⁺, Co⁺⁺ und Zn⁺⁺, während der vollständig katalytischen Stelle in atomarer Detailstudie untersucht, und ihre Aktivität auf Nukleotidyltransferase ist effizienter als die von Mg⁺⁺. Um den neu verlängerten Primerstrang zur katalytischen Stelle für eine neue Addition zu translozieren, muss Metall A austreten und durch Na⁺ ersetzt werden.

Abbildung 3. Mechanismus von TdT, das an eine DNA-Synapse gebunden ist. (Loc’h J. 2018)

TdT kann zufällige Desoxyribonukleotide (dNTPs) zu ssDNA-Primern auf eine vorlagenunabhängige Weise hinzufügen, mit Primern von mindestens 3 Nukleotiden Länge. In vitro-Experimente haben gezeigt, dass TdT vier natürliche dNTPs verwenden kann, aber TdT integriert bevorzugt dCTP und dGTP im Vergleich zu dATP und dTTP. Darüber hinaus kann die TdT-Nukleotidbindungsstelle Desoxyribonukleotide und Ribonukleosidtriphosphate (dNTPs und rNTPs) aufnehmen.

Anwendung

TdT kann als Ziel für die Krebsbekämpfung verwendet werden. Klinische Beweise deuten darauf hin, dass Veränderungen in der TdT-Aktivität und den Expressionsniveaus eine wichtige Rolle bei der Krebsentstehung, -progression und -reaktion auf Chemotherapie spielen. Bei akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL) von B-Zellen und T-Zellen sowie akuter myeloischer Leukämie (AML) ist die TdT-Expression erhöht, und hohe TdT-Aktivitätsniveaus sind mit einer schlechten Prognose verbunden. Studien haben gezeigt, dass TdT-positive Patienten eine zweifache Reduktion der Remissionsrate im Vergleich zu TdT-negativen Leukämiepatienten aufweisen. Diese Erkenntnisse haben die Forschung zu selektiven Inhibitoren von TdT vorangetrieben, die als chemotherapeutische Mittel gegen diese Formen von Leukämie wirken.

TdT kann auch als biochemisches Werkzeug verwendet werden. TdT kann eine Vielzahl von Nukleotidanaloga nutzen und ist tolerant gegenüber einer großen Anzahl von Modifikationen von Nukleasen, was eine effiziente Methode zum Markieren des Bruchs von doppelsträngiger DNA in vivo und in vitro bietet. TUNT (TdT-vermittelte dUTP-Biotin-Nick-End-Markierung) ist eine auf TdT basierende Technologie, die biotinylierte dUMP effizient an das 3'-Ende von einzelsträngiger DNA am DNA-Bruchstelle integriert. Das gebundene Biotin dUMP kann durch fluoreszierende Markierung nachgewiesen werden und kann direkt die Anzahl und den Standort von DNA-Brüchen quantifizieren. Diese Technik wird häufig verwendet, um Apoptose und programmierte Zellnekrose in eukaryotischen Zellen zu erkennen. TdT kann auch als Biokatalysator verwendet werden, um das 3'-Ende eines synthetischen Oligonukleotids mit einem Radionukleotid oder fluoreszierenden Sonden zu markieren. Diese markierten Primer werden an einen komplementären Strang annealiert und können als radioaktives Substrat verwendet werden, um die Aktivität eines Enzyms im Nukleinsäurestoffwechsel nachzuweisen.

Literaturverzeichnis

1. Fowler, J.D., Suo, Z. Biochemical, structural, and physiological characterization of terminal deoxynucleotidyl transferase. Chem. Rev, 2006, 106:2092−2110.
2. Loc’h, J., Delarue, M. Terminal deoxynucleotidyltransferase: the story of an untemplated DNA polymerase capable of DNA bridging and templated synthesis across strands. Curr Opin Struct Biol, 2018, 53:22-31.
3. Motea, E.A., Berdis, A.J. Terminal deoxynucleotidyl transferase: the story of a misguided DNA polymerase. Biochim Biophys Acta, 2010, 1804(5): 1151–1166.