TMPK

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TMPK (EC 2.7.4.9, Thymidinmonophosphat-Kinase) gehört zur Klasse der Transferasen und ist eine Phosphatgruppen-Transferase. Der systematische Name dieses Enzyms lautet ATP:dTMP-Phosphotransferase. Weitere gebräuchliche Bezeichnungen sind u. a. Thymidinmonophosphat-Kinase, Thymidylat-Kinase, Thymidylatmonophosphat-Kinase, Thymidylsäure-Kinase, Thymidylic-Kinase, Desoxythymidin-5'-monophosphat-Kinase, TMPK sowie Thymidin-5'-monophosphat-Kinase. TMPK katalysiert in Anwesenheit von ATP und Mg²⁺ die Phosphorylierung von Thymidin-5’-monophosphat (dTMP) zu Thymidin-5’-diphosphat (dTDP). dTDP wird anschließend durch die Nukleosid-Diphosphat-Kinase (NDK) weiter zu Thymidin-5’-triphosphat (dTTP) phosphoryliert. Als Substrat für TMPK stammt dTMP entweder aus dem Salvage-Pathway oder aus dem de novo-Pathway; damit wirkt TMPK an der Schnittstelle von de novo- und Salvage-Stoffwechselwegen der dTTP-Synthese.

Struktur

TMPK gehört zur NMP-Kinase-Familie, die eine hochkonservierte Faltung aufweist, jedoch weniger konservierte Sequenzen besitzt. Alle TMPKs liegen als Homodimere vor; jede Untereinheit besteht aus 7–11 α-Helices, die einen zentralen Kern aus fünf parallelen β-Strängen umgeben. TMPK umfasst drei Domänen: die ligandinduzierte Deckel- (LID-)Domäne, die NMP-Bindungsstelle und die CORE-Domäne. Die LID-Domäne ist flexibel und umschließt den Phosphatdonor teilweise, wodurch der Transfer von Phosphatgruppen ermöglicht wird. Die CORE-Domäne umfasst eine Phosphatbindeschleife (P-Loop) sowie eine ATP-Bindungsstelle. Der P-Loop enthält die für Substraterkennung und Katalyse erforderlichen Strukturelemente und bindet bzw. positioniert die α- und β-Phosphorylgruppen von ATP. Alle bekannten TMPKs besitzen eine ähnliche CORE-Domäne.

Abbildung 1. Struktur von TMPK. (Cui Q. 2013)

TMPK wird anhand der Position der basischen Aminosäurereste im aktiven Zentrum in zwei Typen klassifiziert. Typ-I-TMPK stammt überwiegend aus Eukaryoten und weist zusätzlich zu dem invarianten Lysinrest im P-Loop weitere basische Reste auf. Typ-II-TMPK stammt überwiegend aus Prokaryoten; hier fehlen basische Reste im P-Loop, stattdessen finden sich basische Reste mit vergleichbarer Funktion in der LID-Domäne. Bemerkenswert ist, dass die TMPK aus M. tuberculosis weder Typ I noch Typ II zuzuordnen ist und zudem einen abweichenden katalytischen Mechanismus aufweist.

Katalytischer Mechanismus

TMPK ist eine Nukleosidmonophosphat-Kinase, die in Anwesenheit von ATP und Mg²⁺ die Umwandlung von dTMP zu dTDP katalysiert: ATP + Thymidin-5'-phosphat ⇌ ADP + Thymidin-5'-diphosphat. Als Substrat für TMPK stammt dTMP überwiegend aus Salvage-Stoffwechselwegen und aus de novo-Synthesewegen; funktionell ist TMPK daher an der Schnittstelle zwischen Salvage- und de novo-Synthesewegen lokalisiert. Die Thymidinbase von dTMP bindet zwischen Phe72 und einer durch Helix 5 des P-Loops gebildeten Oberfläche. Studien zur NMP-Familie zeigten, dass Substrate Konformationsänderungen an der NMP-Bindungsstelle induzieren; zudem wurden mehrere Konformationszustände von TMPK identifiziert, die mit dem katalytischen Mechanismus des Enzyms assoziiert sind. In Abwesenheit eines Liganden liegt TMPK in einem offenen Zustand vor, in dem die LID-Domäne ungeordnet ist. In Anwesenheit von dTMP ist TMPK teilweise geschlossen; in den meisten Strukturen bleibt die LID-Domäne ungeordnet. Wenn beide Substrate gleichzeitig vorliegen, befindet sich TMPK in einem vollständig geschlossenen Zustand und die LID-Domäne ist geordnet. Während des katalytischen Prozesses führt die Bewegung des P-Loops zur Konformationsänderung vom offenen in den geschlossenen Zustand, wodurch die Nukleosidtriphosphat-Einheit in die Nähe des Phosphoryl-Akzeptors gebracht wird.

Abbildung 2. Funktioneller Signal-/Stoffwechselweg der Thymidylat-Kinase. (Lavie A. 2004)

Abbildung 3. Mechanismus der dTMP-Bindung an TMPK. (Lavie A. 2004)

Anwendung

Als Schlüsselenzym der dTTP-Synthese stellt TMPK ein potenzielles Arzneimittel-Target bei einer Vielzahl von Erkrankungen dar, insbesondere bei Infektionskrankheiten. Eine Unterbrechung des dTTP-Metabolismus kann genutzt werden, um die Progression solcher Erkrankungen zu verhindern. Bei der Einnahme des anti-HIV-Nukleosidanalogons AZT wird dieses zunächst durch die Thymidinkinase zu 3'-Azido-3'-desoxythymidinmonophosphat (AZTMP) phosphoryliert. AZTMP wird anschließend durch TMPK zu 3'-Azido-3'-desoxythymidindiphosphat (AZTDP) weiter phosphoryliert. AZTMP ist ein schlechtes Substrat für die humane TMPK (hTMPK), sodass die Umwandlung zu AZTDP den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt im Aktivierungsprozess darstellt. Der abschließende Aktivierungsschritt erfolgt durch die basenunspezifische Nukleosid-Diphosphat-Kinase (NDK) zur Bildung von 3'-Azido-3'-desoxythymidintriphosphat (AZTTP). AZTTP trägt eine 3'-Azidogruppe anstelle der 3'-OH-Gruppe der Ribose, wodurch die DNA-Synthese terminiert wird oder AZTTP als Inhibitor der DNA-Polymerase wirkt und so die DNA-Synthese blockiert. hTMPK ist ein wesentliches Enzym, das die Geschwindigkeit des gesamten Aktivierungsprozesses maßgeblich steuert.

Die Inhibition von TMPK ist eine wirksame Strategie für die Wirkstoffforschung im Bereich von Infektionskrankheiten, etwa bei bakteriellen und parasitären Infektionen. Subtile Unterschiede in den aktiven Zentren von hTMPK und der TMPK von Pathogenen eröffnen die Möglichkeit, selektive Inhibitoren zu entwickeln. Darüber hinaus können hTMPK-Inhibitoren in Kombination mit Antitumorwirkstoffen zur Behandlung bestimmter komplexer Krebserkrankungen eingesetzt werden.

Literatur

1. Cui, Q., Shin, W.S., Luo, Y., Tian, J., Cui, H., Yin, D. Thymidylate kinase: an old topic brings new perspectives. Curr Med Chem, 2013, 20(10):1286-305.
2. Lavie, A., Konrad, M. Structural requirements for efficient phosphorylation of nucleotide analogs by human thymidylate kinase. Mini Rev Med Chem, 2004, 4(4):351-9.