TMPK

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TMPK (EC 2.7.4.9, Thymidinmonophosphatkinase) gehört zur Klasse der Transferasen und ist eine Phosphatgruppen-Transferase. Der systematische Name dieses Enzyms ist ATP:dTMP-Phosphotransferase. Andere gebräuchliche Namen sind Thymidinmonophosphatkinase, Thymidylatkinase, Thymidylatmonophosphatkinase, Thymidylsäurekinase Thymidylkinase, Deoxythymidin-5'-monophosphatkinase, TMPK und Thymidin-5'-monophosphatkinase. TMPK katalysiert die Phosphorylierung von Thymidin-5’-monophosphat (dTMP) zur Bildung von Thymidin-5’-diphosphat (dTDP) in Anwesenheit von ATP und Mg²⁺. dTDP wird weiter von Nukleosid-Diphosphat-Kinase (NDK) phosphoryliert, um Thymidin-5’-triphosphat (dTTP) zu produzieren. Als Substrat für TMPK stammt dTMP entweder aus dem Salvage-Weg oder aus dem de novo Weg, sodass TMPK an der Schnittstelle von de novo und Salvage-Wegen der dTTP-Synthese wirkt.

Struktur

TMPK gehört zur Familie der NMP-Kinasen, die eine hochkonservierte Faltung aufweist, aber weniger konservierte Sequenzen hat. TMPKs sind alle Homodimere, wobei jede Untereinheit aus 7-11 α-Helices besteht, die eine zentrale Anordnung von 5 parallelen β-Strängen umgeben. TMPK enthält drei Domänen: die ligandinduzierte Degradationsdomäne (LID), die NMP-Bindungsstelle und die CORE-Domäne. Die LID-Domäne ist flexibel und umgibt teilweise den Phosphatdonor, was den Transfer von Phosphatgruppen ermöglicht. Die CORE-Domäne umfasst eine Phosphatbindeschleife (P-Schleife) und eine ATP-Bindungsstelle. Die P-Schleife enthält die strukturellen Elemente, die für die Substraterkennung und Katalyse erforderlich sind, und die P-Schleife bindet und lokalisiert sich an α und β Phosphorylgruppen von ATP. Alle bekannten TMPKs haben eine ähnliche CORE-Domäne.

Abbildung 1. Struktur von TMPK. (Cui Q. 2013)

TMPK wird in zwei Typen eingeteilt, basierend auf der Position des basischen Restes seiner aktiven Stelle. Typ I TMPK stammt hauptsächlich von Eukaryoten und hat basische Reste zusätzlich zu dem invarianten Lysinunfall in der P-Schleife. Typ II TMPK stammt hauptsächlich von Prokaryoten, die in der P-Schleife keine basischen Reste aufweisen, aber basische Reste mit ähnlichen Effekten in der LID-Domäne haben. Es ist erwähnenswert, dass M. tuberculosis TMPK weder Typ I noch Typ II ist und sein katalytischer Mechanismus ebenfalls anders ist.

Katalytischer Mechanismus

TMPK ist eine Nukleosidmonophosphatkinase, die die Umwandlung von dTMP zu dTDP in Anwesenheit von ATP und Mg²⁺ katalysiert: ATP + Thymidin-5'-phosphat ⇌ ADP + Thymidin-5'-diphosphat. Als Substrat für TMPK stammt dTMP hauptsächlich aus Salvage-Wegen und de novo-Synthesewegen, sodass TMPK funktionell an der Schnittstelle von Salvage-Wegen und de novo-Synthesewegen lokalisiert ist. Die Thymidinbase von dTMP bindet zwischen Phe72 und einer Fläche, die von Helix 5 der P-Schleife gebildet wird. Die Studien der NMP-Familie haben gezeigt, dass Substrate Veränderungen in der Konformation der NMP-Bindungsstelle induzieren, und mehrere konformationale Zustände von TMPK, die mit dem katalytischen Mechanismus des Enzyms verbunden sind, wurden entdeckt. In Abwesenheit eines Liganden ist TMPK im offenen Zustand, in dem die LID-Domäne ungeordnet ist. In Anwesenheit von dTMP ist TMPK teilweise geschlossen und die LID-Domäne ist in den meisten Strukturen ungeordnet. In dem Fall, dass beide Substrate koexistieren, ist TMPK im vollständig geschlossenen Zustand und die LID-Domäne ist geordnet. Während des katalytischen Prozesses verursacht die Bewegung der P-Schleife die Konformationsänderung von einem offenen Zustand zu einem geschlossenen Zustand, wodurch die Nukleosidtriphosphatgruppe nahe an den Phosphoryl-Akzeptor gebracht wird.

Abbildung 2. Funktioneller Weg der Thymidylatkinase. (Lavie A. 2004)

Abbildung 3. Mechanismus von dTMP, das an TMPK gebunden ist. (Lavie A. 2004)

Anwendung

Als Schlüsselenzym in der dTTP-Synthese kann TMPK ein potenzielles Ziel für Medikamente bei einer Vielzahl von Krankheiten sein, insbesondere bei Infektionskrankheiten. Die Unterbrechung des dTTP-Stoffwechsels könnte verwendet werden, um die Entwicklung solcher Krankheiten zu verhindern. Als der Patient das anti-HIV-Nukleosidanalogon AZT einnahm, wurde es zunächst von der Thymidinkinase zu 3'-Azido-3'-deoxythymidinmonophosphat (AZTMP) phosphoryliert. AZTMP wird weiter von TMPK zu 3'-Azido-3'-deoxythymindiphosphat (AZTDP) phosphoryliert. AZTMP ist ein schlechtes Substrat für die menschliche TMPK (hTMPK), sodass die Umwandlung zu AZTDP der geschwindigkeitsbestimmende Schritt im Aktivierungsprozess ist. Der letzte Aktivierungsschritt wird von der basenunspezifischen Nukleosid-Diphosphat-Kinase (NDK) durchgeführt, um 3'-Azido-3'-deoxythymidintriphosphat (AZTTP) zu bilden. AZTTP hat die 3'-Azido-Gruppe, die die 3'-OH-Gruppe von Ribose ersetzt, was die DNA-Synthese beendet oder als Inhibitor der DNA-Polymerase wirkt, um die DNA-Synthese zu blockieren. hTMPK ist ein wichtiges Enzym, das die Rate des Prozesses während des gesamten Aktivierungsprozesses steuert.

Die Hemmung von TMPK ist eine effektive Strategie zur Entdeckung von Medikamenten gegen Infektionskrankheiten, wie bakterielle und parasitäre Infektionen. Subtile Unterschiede in den aktiven Stellen von hTMPK und pathogenen TMPK bieten die Möglichkeit, selektive Inhibitoren zu entwerfen. Darüber hinaus können hTMPK-Inhibitoren in Kombination mit Antikrebsagenten zur Behandlung einiger komplexer Krebserkrankungen eingesetzt werden.

Referenzen

1. Cui, Q., Shin, W.S., Luo, Y., Tian, J., Cui, H., Yin, D. Thymidylate kinase: an old topic brings new perspectives. Curr Med Chem, 2013, 20(10):1286-305.
2. Lavie, A., Konrad, M. Structural requirements for efficient phosphorylation of nucleotide analogs by human thymidylate kinase. Mini Rev Med Chem, 2004, 4(4):351-9.