Trypsin

Trypsin (EC 3.4.21.4) ist eine serine Protease aus der Bauchspeicheldrüse der S1-Familie und der PA-Clan-Superfamilie. Trypsin ist ein proteolytisches Enzym, das im Verdauungssystem vorkommt und wichtig für die Verdauung von Proteinen ist. Bei Menschen wird Trypsin zunächst in seiner inaktiven Form, Trypsinogen, in der Bauchspeicheldrüse produziert. Dann gelangt Trypsinogen in den Dünndarm und wird in aktives Trypsin umgewandelt. Die Hauptfunktion von Trypsin besteht darin, Peptidketten an der Carboxylseite der Aminosäuren Lysin oder Arginin zu spalten, es sei denn, eine dieser Aminosäuren wird von Prolin gefolgt. Die beiden Hauptformen von Trypsin sind α-Trypsin und β-Trypsin.

Struktur

Bovines Trypsinogen besteht aus einer einzelnen Polypeptidkette von 229 Aminosäuren und ist durch sechs Disulfidbrücken vernetzt. Trypsin besteht aus einer einzelnen Polypeptidkette von 223 Aminosäuren. Die aktive Stelle von Trypsin umfasst His46 und Ser183. Die native Form von Trypsin wird als β-Trypsin bezeichnet, das autolysiert werden kann, um α-Trypsin zu bilden und durch Disulfidbrücken zusammengehalten wird. Die Autolyse von β-Trypsin erfolgt an Lys131 und Ser132 in der bovinen Sequenz.

Abbildung 1. Die Struktur von Trypsinogen (links) und Trypsin (rechts). (Elgendy, A. S. 2016)

Die Struktur von Trypsin und Chymotrypsin ist sehr ähnlich, aber es gibt einen wichtigen Unterschied zwischen den beiden Strukturen. Die Spezifitätstasche von Chymotrypsin enthält ein Serin an der Position 189, während Trypsin an dieser Position eine Asparaginsäure enthält. Basierend auf dem strukturellen Unterschied wählt Chymotrypsin die aromatischen Aminosäuren, die hydrophob sind, während Trypsin die basischen Aminosäuren wählt, die eine positive Ladung enthalten.

Mechanismus

Trypsin kann die Hydrolysereaktion katalysieren, um Peptide in Aminosäuren abzubauen, und teilt einen allgemeinen katalytischen Mechanismus mit anderen serinen Proteasen. Die aktive Stelle von Trypsin besteht aus drei Aminosäuren, nämlich Serin 195, Histidin 57 und Asparagin 102, die als katalytisches Triade bezeichnet werden. Die Schritte des katalytischen Prozesses von Trypsin umfassen:

• Substratbindung. Die Seitenkette der Aminosäure des Substrats kann an die aktive Stelle von Trypsin binden, wobei das Carbonyl-Kohlenstoffatom dieser Bindung in der Nähe des nucleophilen Serin 195 positioniert ist.
• Nucleophiler Angriff. Histidin 57 erleichtert, dass die Hydroxylgruppe des nucleophilen Serin 195 ein Proton abstrahiert, um das Carbonyl-Kohlenstoffatom anzugreifen. Eine kovalente Bindung wird zwischen der Ser195-Seitenkette und dem Substrat aufgrund der nucleophilen Angriffe erzeugt. Eine Wasserstoffbrücke stabilisiert die negative Ladung, die sich auf dem Peptid-Carbonyl-Sauerstoff entwickelt, der aus zwei Amid-Protonen des Protease-Rückgrats stammt.
• Protonierung. Der Amidstickstoff des Substrats erhält ein Wasserstoffatom von His57, was die Freisetzung des Carboxylterminus des Substrats als freies Peptid ermöglicht.
• Esterhydrolyse. Der letzte Schritt ist der Angriff von Wasser auf die Esterbindung zwischen dem Peptid und dem Ser195-Sauerstoff. Peptid mit einer normalen Carboxylgruppe wird ein zweites Produkt und regeneriert die Serin-Hydroxylgruppe. Das zweite Peptid dissoziiert dann von dem Enzym, um einen weiteren katalytischen Zyklus zu beginnen.

Abbildung 2. Katalytischer Mechanismus von Trypsin.

Physiologische Funktionen

Trypsin ist ein wichtiges Verdauungsenzym, das in Bauchspeicheldrüsensäften vorhanden ist. Die Bauchspeicheldrüse setzt Trypsinogen, Chymotrypsinogen und Procarboxypeptidase frei, wenn Protein den Zwölffingerdarm erreicht. Sobald Trypsinogen mit Enterokinase in Kontakt kommt, die von den Schleimhautzellen des Dünndarms über den Pankreasgang ausgeschüttet wird, wird Trypsin aktiviert. Dann ist Trypsin verantwortlich für die Aktivierung von Zymogenen anderer Verdauungsenzyme, einschließlich Procarboxypeptidase und Chymotrypsinogen, die in Chymotrypsin und Carboxypeptidase umgewandelt werden. Darüber hinaus kann Trypsin Peptide in kleinere Formen von Aminosäuren hydrolysieren. Daher fungiert Trypsin hauptsächlich als hydrolysierender biologischer Katalysator für Peptidbindungen.

Anwendungen

Da Trypsin leicht in hoher Menge und hoher Reinheit verfügbar ist, wird es in verschiedenen biotechnologischen Anwendungen weit verbreitet eingesetzt. Während der Zellkultur wird Trypsin verwendet, um adhärente Zellen während des Zellpassage- und Ernteprozesses wieder in Suspension zu bringen. Trypsin kann auch verwendet werden, um dissezierte Zellen vor der Zellfixierung und -sortierung zu dissoziieren. Trypsin kann das Kasein in der Muttermilch abbauen, wodurch die Milch durchscheinend wird, was zur Messung der Reaktionsgeschwindigkeit verwendet werden kann. In der biologischen Forschung wird Trypsin häufig verwendet, um Proteine während Proteomik-Experimenten für die Massenspektrometrie in Peptide zu verdauen. Im medizinischen Bereich kann Trypsin auch verwendet werden, um Blutgerinnsel aufzulösen und Entzündungen zu behandeln.

Referenz