D-LDH

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Einführung

Einige Atmungsproteine enthalten integrale Membransubeinheiten (wie Fumaratreduktase, Succinatdehydrogenase), während andere periphere Membranproteine sind, wie D-Lactatdehydrogenase (D-LDH). Diese Atmungsenzyme können verschiedene organische Substrate (wie Formiat, Lactat, Succinat) oxidieren und dann Elektronen an verschiedene Oxidationsmittel (wie Sauerstoff, Nitrat, Fumarat) übertragen. Die aus diesen Reaktionen gewonnene freie Energie kann von anderen Membranproteinen genutzt werden, wie z.B. für den Stofftransport oder die ATP-Synthese. E. coli verwendet D-Lactat als Kohlenstoffquelle, um zwei Elektronen und zwei Protonen an die Elektronentransferkette zu übertragen. Der Elektronenakzeptor ist Chinon, und alle Reaktionen finden an der zytoplasmatischen Oberfläche der inneren Membran statt.

Die Trennung und Reinigung von D-LDH erfordert Detergenzien, und eine Vielzahl von Detergenzien und Lipiden kann die Enzymaktivität erhöhen. Studien haben gezeigt, dass D-LDH aus E. coli-Membranen mit 0,6 M Guanidinhydrochlorid eluiert werden kann, und seine Aminosäurezusammensetzung ist nicht besonders unpolar. Dies deutet darauf hin, dass D-LDH wie einige andere primäre Dehydrogenasen, die am Elektronentransfer in E. coli beteiligt sind, ein peripheres Protein und kein integrales Membranprotein ist. D-LDH besteht aus 571 Aminosäureresten und ist eine 65 kDa lange Protein-Kette. Die Reduktion von D-LDH durch das Substrat D-Lactat zeigt zwei Phasen. Die schnelle Phase repräsentiert die rasche Bildung des Enzym-Substrat-Komplexes, und die langsame Phase repräsentiert die langsame Freisetzung des Produkts Pyruvat aus dem Enzym. Ein anionisches D-LDH-Semiquinon (ein Elektron ist reduziert) wurde beobachtet und identifiziert, indem während der Oxidation des reduzierten Enzyms durch Nitroxid-Spin-Labels optische und elektronische paramagnetische Resonanzspektroskopie verwendet wurde.

D-LDH gehört zur kürzlich entdeckten Familie der FAD-abhängigen Proteine, und sie teilen sich konservierte Reste in ihren FAD-Bindungsdomänen. Diese Familie umfasst Proteine wie p-Kresol-Methylhydroxylase (PCMH), Vanillylalcohol-Oxidase und UDP-N-Acetylenolpyruvylglucosamin (MurB). Diese Proteine sind sowohl in Eukaryoten als auch in Eubakterien zu finden und katalysieren eine Vielzahl von Redoxreaktionen in verschiedenen Organismen. Der bedeutendste strukturelle Unterschied zwischen D-LDH und den anderen Proteinen dieser FAD-Familie liegt im Membranbindungsbereich. Basierend auf diesen strukturellen Unterschieden und Vergleichen mit den Strukturen anderer peripherer Membranproteine haben Wissenschaftler ein Modell für die Assoziation von D-LDH mit den Membranen vorgeschlagen.

Abbildung 1. Cartoon von D-LDH, das sich mit der Membran verbindet

Vergleich mit anderen Mitgliedern der FAD-Familie

Die Struktur von D-LDH besteht aus drei diskreten Domänen, nämlich der FAD-Bindungsdomäne (Reste 1-268 und 520-571), der Kappen-Domäne (Reste 269-310, 388-425 und 450-519) und der Membranbindungsdomäne (Reste 311-387 und 426-449, von denen die Reste 329-376 im ungeordneten Bereich liegen). Die FAD-Bindungsdomäne besteht aus zwei α+β-Subdomänen. Die Kappen-Domäne besteht aus einem 7-strängigen antiparallelen β-Faltblatt, mit α-Helix auf jeder Seite. Die Membranbindungsdomäne besteht aus vier α-Helices. Es gibt hydrophobe und polare Wechselwirkungen an der Kontaktoberfläche zwischen der FAD-Bindungs- und der Kappen-Domäne sowie zwei Salzbrücken (Arg-40-Asp-498 und Arg-136-Glu-271) an den Extremitäten der Oberfläche. Die einzige Wechselwirkung zwischen Leu-327 und Phe-39 existiert an der Schnittstelle zwischen der FAD- und der Membranbindungsdomäne.

Nach dem Screening der Datenbank mit der D-LDH-Sequenz unter Verwendung der BLAST-Profilmethode und des Programms zur multiplen Ausrichtung wurde festgestellt, dass D-LDH zur kürzlich entdeckten FAD-abhängigen Proteinfamilie gehört, die durch das Teilen einer konservierten FAD-Bindungsdomäne gekennzeichnet ist. Obwohl die Sequenzidentität zwischen D-LDH und seinen Familienmitgliedern (wie MurB, PCMH, usw.) in der gesamten Ausrichtung weniger als 15 % beträgt, teilen sie einige konservierte Reste im N-terminalen Bereich, einschließlich einiger FAD-Bindungsdomänen. Einige dieser konservierten Reste sind an der Bindung von FAD-Kofaktoren beteiligt, und einige befinden sich in der Nähe der Bindungsstelle. Infolgedessen zeigt das Programm DALI, dass die Struktur der FAD-Bindungsdomäne homolog in all diesen Proteinen ist und sich von der Rossmann-Faltung unterscheidet. Obwohl es keine offensichtliche Sequenzähnlichkeit gibt, wird diese strukturelle Ähnlichkeit in geringerem Maße in der Kappen-Domäne beobachtet.

Abbildung 2. Vergleich der drei einzelnen Domänen von D-LDH mit den entsprechenden Domänen von PCMH und MurB