D‑LDH

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Einleitung

Einige respiratorische Proteine enthalten integrale Membranuntereinheiten (z. B. Fumaratreduktase, Succinatdehydrogenase), während andere periphere Membranproteine sind, wie etwa die D‑Laktatdehydrogenase (D‑LDH). Diese respiratorischen Enzyme können verschiedene organische Substrate (z. B. Formiat, Laktat, Succinat) oxidieren und anschließend Elektronen auf unterschiedliche Oxidationsmittel (z. B. Sauerstoff, Nitrat, Fumarat) übertragen. Die aus diesen Reaktionen gewonnene freie Energie kann von anderen Membranproteinen genutzt werden, etwa für den Soluttransport oder die ATP‑Synthese. E. coli nutzt D‑Laktat als Kohlenstoffquelle, um zwei Elektronen und zwei Protonen in die Elektronentransportkette einzuspeisen. Der Elektronenakzeptor ist Chinon, und sämtliche Reaktionen finden an der zytoplasmatischen Oberfläche der inneren Membran statt.

Die Abtrennung und Aufreinigung von D‑LDH erfordert Detergenzien, und eine Vielzahl von Detergenzien und Lipiden kann die Enzymaktivität steigern. Studien haben gezeigt, dass D‑LDH aus E. coli-Membranen mit 0,6 M Guanidinhydrochlorid eluiert werden kann und dass seine Aminosäurezusammensetzung nicht besonders unpolar ist. Dies weist darauf hin, dass D‑LDH – wie einige andere primäre Dehydrogenasen, die am Elektronentransfer in E. coli beteiligt sind – peripher ist, also ein peripheres Protein und kein integrales Membranprotein. D‑LDH besteht aus 571 Aminosäureresten und ist eine einzelne Proteinkette mit 65 kDa. Die Reduktion von D‑LDH durch das Substrat D‑Laktat verläuft zweiphasig. Die schnelle Phase entspricht der raschen Bildung des Enzym‑Substrat‑Komplexes, und die langsame Phase entspricht der langsamen Freisetzung des Produkts Pyruvat aus dem Enzym. Während der Oxidation des reduzierten Enzyms durch Nitroxid‑Spin‑Labels wurde ein anionisches D‑LDH‑Semichinon (um ein Elektron reduziert) beobachtet und mittels optischer Spektroskopie sowie Elektronenparamagnetischer Resonanzspektroskopie (EPR) identifiziert.

D‑LDH gehört zu einer erst kürzlich beschriebenen Familie FAD‑abhängiger Proteine, die konservierte Reste in ihren FAD‑Bindedomänen aufweisen. Zu dieser Familie zählen Proteine wie p-Kresol‑Methylhydroxylase (PCMH), Vanillylalkohol‑Oxidase und UDP‑N-Acetylenolpyruvylglucosamin (MurB). Diese Proteine kommen sowohl in Eukaryoten als auch in Eubakterien vor und katalysieren in unterschiedlichen Organismen eine Vielzahl von Redoxreaktionen. Der markanteste strukturelle Unterschied zwischen D‑LDH und den übrigen Proteinen dieser FAD‑Familie liegt in der Membranbindedomäne. Auf Basis dieser strukturellen Unterschiede und durch Vergleich mit den Strukturen anderer peripherer Membranproteine wurde ein Modell für die Assoziation von D‑LDH mit Membranen vorgeschlagen.

Abbildung 1. Schematische Darstellung der Assoziation von D‑LDH mit der Membran

Vergleich mit anderen Mitgliedern der FAD‑Familie

Die D‑LDH‑Struktur besteht aus drei klar abgegrenzten Domänen, nämlich der FAD‑Bindedomäne (Reste 1–268 und 520–571), der Cap‑Domäne (Reste 269–310, 388–425 und 450–519) und der Membranbindedomäne (Reste 311–387 und 426–449, wobei die Reste 329–376 in der ungeordneten Region lokalisiert sind). Die FAD‑Bindedomäne setzt sich aus zwei α+β‑Subdomänen zusammen. Die Cap‑Domäne besteht aus einem antiparallelen β‑Faltblatt mit sieben Strängen, flankiert von je einer α‑Helix auf jeder Seite. Die Membranbindedomäne besteht aus vier α‑Helices. An der Kontaktfläche zwischen der FAD‑Bindedomäne und der Cap‑Domäne liegen hydrophobe und polare Wechselwirkungen vor sowie zwei Salzbrücken (Arg‑40–Asp‑498 und Arg‑136–Glu‑271) an den Randbereichen der Oberfläche. Die einzige Wechselwirkung zwischen Leu‑327 und Phe‑39 befindet sich an der Grenzfläche zwischen der FAD‑ und der Membranbindedomäne.

Nach Durchmusterung der Datenbank mit der D‑LDH‑Sequenz mittels BLAST‑Profilmethode und Programmen zur multiplen Sequenzalignierung wurde festgestellt, dass D‑LDH zu der kürzlich beschriebenen Familie FAD‑abhängiger Proteine gehört, die durch eine konservierte FAD‑Bindedomäne charakterisiert ist. Obwohl die Sequenzidentität zwischen D‑LDH und den Familienmitgliedern (z. B. MurB, PCMH, etc.) über das gesamte Alignment hinweg unter 15 % liegt, teilen sie einige konservierte Reste in der N‑terminalen Region, einschließlich Teilen der FAD‑Bindedomäne. Einige dieser konservierten Reste sind an der Bindung des FAD‑Kofaktors beteiligt, andere liegen in der Nähe der Bindestelle. Entsprechend zeigt – wie durch das Programm DALI dargestellt – die Struktur der FAD‑Bindedomäne in all diesen Proteinen Homologie und unterscheidet sich von der Rossmann‑Faltung. Obwohl keine ausgeprägte Sequenzähnlichkeit vorliegt, ist diese strukturelle Ähnlichkeit in geringerem Ausmaß auch in der Cap‑Domäne zu beobachten.

Abbildung 2. Vergleich der drei Einzeldomänen von D‑LDH mit den entsprechenden Domänen von PCMH und MurB