GLDH

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Einführung

Glutamatdehydrogenase (GLDH oder GDH) ist ein hexameres Enzym, das für die reversible Umwandlung von Glutamat in α-Ketoglutarat und Ammoniak verantwortlich ist, während NAD(P)⁺ zu NAD(P)H reduziert wird. Neben der Förderung der Anaplerose des Krebszyklus und der Energieproduktion ist GDH auch eng mit der Zell-Signaltransduktion und der Redox-Homöostase verbunden.

Verschiedene GDH-Isoenzyme werden normalerweise in niederen Lebensformen wie Bakterien oder Hefen exprimiert, und diese Isoenzyme haben eine strikte Spezifität für NAD⁺ oder NADP⁺. NAD⁺-abhängige GDH spielt hauptsächlich eine metabolische Rolle, während NADP⁺-spezifische Enzyme an biosynthetischen Funktionen beteiligt sind. Drei verschiedene GDH-Isoenzyme wurden in der Hefe Saccharomyces cerevisiae identifiziert: yGDH1 (NADP⁺-Spezifität), yGDH2 (NAD⁺-Spezifität) und yGDH3 (NADP⁺-Spezifität). Das NAD⁺-spezifische Isoenzym (yGDH2) spielt eine Rolle bei der oxidativen Deaminierung von Glutamat zu α-Ketoglutarat und Ammoniak, während die NADP⁺-spezifischen Isoenzyme (yGDH1, yGDH3) hauptsächlich an der Glutamatbiosynthese beteiligt sind. In niederen Organismen wird die Regulation von GDH auf transkriptionaler Ebene erreicht. In Arabidopsis thaliana wird die NAD⁺-spezifische GDH von drei verschiedenen Genen (aGDH1, aGDH2 und aGDH3) kodiert. In Oryza sativa (Reis) wird die NAD⁺-spezifische oGDH ebenfalls von drei verschiedenen Genen kodiert, die unterschiedliche Expressionsmuster aufweisen. Gleichzeitig wurden auch NADP⁺-spezifische GDH-Proteine in einer Reihe von höheren Pflanzen identifiziert. Bei Säugetieren hat sich GDH zu einem hochregulierten Enzym mit doppelter Coenzym-Spezifität entwickelt. Die Säugetier-GDH1 (hGDH1 bei Menschen) kann eine wichtige Rolle im Katabolismus und in der Zellensynthese spielen. Darüber hinaus wird GDH1 auch durch ein komplexes allosterisches Regulationssystem kontrolliert.

Abbildung 1. Der Glutamatdehydrogenase (GDH) Weg und die Funktion des Krebszyklus (Plaitakis, A.; et al. 2017)

Struktur

GDH ist ein Hexamer, das aus sechs Untereinheiten besteht. Jede dieser Peptide enthält ungefähr 500 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von etwa 56 kDa. Das hexamere Enzym besteht aus zwei Trimeren, von denen jeder drei funktionale Domänen enthält: NAD⁺-Bindung, Glutamat-Bindung und regulatorische Domänen. Im Trimer sind die Antennen der benachbarten Untereinheiten miteinander verflochten, wobei diese Interaktion zwischen den Untereinheiten als Vermittler der Allostrie gedacht wird, aber der genaue Mechanismus ist nicht vollständig verstanden.

In den letzten Jahrzehnten hat der Erwerb von hochauflösenden Röntgenstrukturen verschiedener GDHs uns ein tiefes Verständnis der molekularen Mechanismen ihrer katalytischen Funktionen vermittelt. Neueste Studien zur Säugetier-GDH1 (die fortgeschrittene Struktur einschließlich der "Antenne") haben gezeigt, dass die Hexamerstruktur in jedem katalytischen Zyklus signifikante konformationale Veränderungen durchläuft. Es wurde beobachtet, dass, wenn der katalytische Spalt sich öffnet, sich die NAD⁺-Domäne von der Glutamat-Bindungsdomäne entfernt und sich im Uhrzeigersinn um die Antenne dreht. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass Mutationen von Aminosäuren, die sich in dieser Helix in hGDH1 befinden, den GTP-hemmenden Effekt schwächen und das Hyperinsulinämie/Hyperammonämie (HI/HA) Syndrom verursachen, was die Bedeutung der kleinen Helix unterstreicht.

Abbildung 2. Strukturelles Modell von hGDH1 (Plaitakis, A.; et al. 2017)

Die GDH-Katalyse

Studien haben gezeigt, dass das thermodynamische Gleichgewicht der Säugetier-GDH die Synthese von Glutamat fördern kann, aber es ist noch unklar, ob das Enzym in Richtung der Oxidations-Deaminierung in vivo wirkt. Der katalytische Effekt von GDH wird durch Substratkonzentration, ionische Stärke, pH-Wert und Pufferzusammensetzung beeinflusst. Studien an gereinigter GDH aus Säugetiergeweben oder rekombinanter hGDH1 zeigen, dass der optimale pH-Bereich des Enzyms 7,75-8,00 beträgt und die ADP-Aktivierung bei niedrigeren pH-Werten signifikant reduziert ist. Der optimale pH von hGDH2 beträgt 7,50, und das Enzym kann auch bei noch niedrigeren pH-Werten (7,25 bis 7,0) effektiv arbeiten. Aufgrund des relativ hohen Km von Ammoniak wird erwartet, dass GDH in Richtung der oxidativen Deaminierung arbeitet, insbesondere in Geweben, in denen die Ammoniakkonzentration normalerweise niedrig ist.

Die gezielte Mutagenese in hGDH1 an Stellen, die sich von hGDH2 unterscheiden, zeigte, dass eine einzelne evolutionäre Aminosäure-Substitution (Arg443Ser), die sich in der absteigenden Kette der Antenne befindet, die katalytische Aktivität reduzierte und die Aktivierung von L-Leucin eliminierte. Darüber hinaus machen die Änderungen in Arg443Ser das Enzym hitzelabil und erhöhen seine Empfindlichkeit gegenüber Steroidhormonen. Andere funktionale Analysen von menschlichen GDHs zeigen, dass die Grundaktivität von hGDH2 von der Konzentration des Rekombinase während des Tests abhängt. Die Abhängigkeit des Wildtyp-hGDH2 und des hGDH1-Mutanten von der Enzym-Protein-Konzentration wird als mit der Störung der Wasserstoffbrücke zwischen Arg443-Ser409 in den Antennen verbunden angesehen. Im Gegensatz zu hGDH2 und hGDH1-Mutanten hat die Änderung der Protein-Konzentration des Wildtyps hGDH1 nur geringe Auswirkungen auf seine spezifische Aktivität.