GLDH

Verwandte Lektüre

Einleitung

Glutamatdehydrogenase (GLDH bzw. GDH) ist ein hexameres Enzym, das die reversible Umwandlung von Glutamat zu α‑Ketoglutarat und Ammoniak katalysiert und dabei NAD(P)⁺ zu NAD(P)H reduziert. Neben der Förderung der Anaplerose des Krebs-Zyklus und der Energiegewinnung ist GDH zudem eng mit der zellulären Signaltransduktion und der Redox‑Homöostase verknüpft.

Unterschiedliche GDH‑Isoenzyme werden üblicherweise in niederen Organismen wie Bakterien oder Hefen exprimiert; diese Isoenzyme weisen eine strikte Spezifität für NAD⁺ bzw. NADP⁺ auf. NAD⁺-abhängige GDH erfüllt vorwiegend eine metabolische Funktion, während NADP⁺-spezifische Enzyme an biosynthetischen Prozessen beteiligt sind. In der Hefe Saccharomyces cerevisiae wurden drei verschiedene GDH‑Isozyme identifiziert: yGDH1 (NADP⁺-Spezifität), yGDH2 (NAD⁺-Spezifität) und yGDH3 (NADP⁺-Spezifität). Das NAD⁺-spezifische Isoenzym (yGDH2) spielt eine Rolle bei der oxidativen Desaminierung von Glutamat zu α‑Ketoglutarat und Ammoniak, während die NADP⁺-spezifischen Isoenzyme (yGDH1, yGDH3) hauptsächlich an der Glutamatbiosynthese beteiligt sind. In niederen Organismen erfolgt die Regulation der GDH auf transkriptioneller Ebene. In Arabidopsis thaliana wird die NAD⁺-spezifische GDH durch drei unterschiedliche Gene kodiert (aGDH1, aGDH2 und aGDH3). In Oryza sativa (Reis) wird die NAD⁺-spezifische oGDH ebenfalls durch drei verschiedene Gene kodiert, die unterschiedliche Expressionsmuster aufweisen. Gleichzeitig wurden NADP⁺-spezifische GDH‑Proteine auch in einer Reihe höherer Pflanzen identifiziert. Bei Säugetieren hat sich GDH zu einem hochregulierten Enzym mit dualer Koenzym‑Spezifität entwickelt. Die Säugetier‑GDH1 (beim Menschen hGDH1) kann eine wichtige Rolle im Katabolismus und in der Zellbiosynthese spielen. Darüber hinaus unterliegt GDH1 einem komplexen allosterischen Regulationssystem.

Abbildung 1. Der Glutamatdehydrogenase-(GDH)-Signalweg und die Funktion des Krebs-Zyklus (Plaitakis, A.; et al. 2017)

Struktur

GDH ist ein Hexamer, das aus sechs Untereinheiten besteht. Jedes dieser Peptide umfasst etwa 500 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von ca. 56 kDa. Das hexamere Enzym setzt sich aus zwei Trimern zusammen, die jeweils drei funktionelle Domänen enthalten: eine NAD⁺-Bindedomäne, eine Glutamat‑Bindedomäne und eine regulatorische Domäne. Im Trimer sind die „Antennen“ benachbarter Untereinheiten miteinander verflochten; diese Interaktion zwischen Untereinheiten gilt als Vermittler allosterischer Effekte, der genaue Mechanismus ist jedoch nicht vollständig geklärt.

In den letzten Jahrzehnten haben hochauflösende Röntgenstrukturanalysen verschiedener GDHs ein vertieftes Verständnis der molekularen Mechanismen ihrer katalytischen Funktion ermöglicht. Neuere Untersuchungen zur Säugetier‑GDH1 (erweiterte Struktur einschließlich der „Antenne“) zeigen, dass die Hexamerstruktur in jedem katalytischen Zyklus ausgeprägte Konformationsänderungen durchläuft. Es wurde beobachtet, dass sich beim Öffnen der katalytischen Spalte die NAD⁺-Domäne von der Glutamat‑Bindedomäne wegbewegt und sich im Uhrzeigersinn um die Antenne dreht. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass Mutationen von Aminosäuren, die in dieser Helix von hGDH1 lokalisiert sind, die GTP‑vermittelte Hemmung abschwächen und ein Hyperinsulinämie-/Hyperammonämie-(HI/HA)-Syndrom verursachen, was die Bedeutung dieser kurzen Helix unterstreicht.

Abbildung 2. Strukturmodell von hGDH1 (Plaitakis, A.; et al. 2017)

GDH‑Katalyse

Studien zeigen, dass das thermodynamische Gleichgewicht der Säugetier‑GDH die Synthese von Glutamat begünstigen kann; es ist jedoch weiterhin unklar, ob das Enzym in vivo in Richtung der oxidativen Desaminierung wirkt. Die katalytische Aktivität der GDH wird durch Substratkonzentration, Ionenstärke, pH‑Wert und Pufferzusammensetzung beeinflusst. Untersuchungen an gereinigter GDH aus Säugetiergeweben oder rekombinanter hGDH1 zeigen, dass der optimale pH‑Bereich des Enzyms bei 7,75–8,00 liegt und die ADP‑Aktivierung bei niedrigeren pH‑Werten deutlich reduziert ist. Der optimale pH‑Wert von hGDH2 beträgt 7,50; das Enzym kann auch bei noch niedrigeren pH‑Werten (7,25 bis 7,0) effektiv arbeiten. Aufgrund des relativ hohen Km für Ammoniak ist zu erwarten, dass GDH insbesondere in Geweben, in denen die Ammoniakkonzentration üblicherweise niedrig ist, in Richtung der oxidativen Desaminierung arbeitet.

Eine ortsgerichtete Mutagenese in hGDH1 an Positionen, die sich von hGDH2 unterscheiden, zeigte, dass eine einzelne evolutionäre Aminosäuresubstitution (Arg443Ser) in der absteigenden Kette der Antenne die katalytische Aktivität reduzierte und die L‑Leucin‑Aktivierung eliminierte. Darüber hinaus macht die Arg443Ser‑Änderung das Enzym thermolabil und erhöht seine Sensitivität gegenüber Steroidhormonen. Weitere Funktionsanalysen humaner GDHs zeigen, dass die Grundaktivität von hGDH2 während des Assays von der Konzentration der Rekombinase abhängt. Es wird angenommen, dass die Abhängigkeit des Wildtyp‑hGDH2 und des hGDH1‑Mutanten von der Enzymproteinkonzentration mit der Störung der Arg443‑Ser409‑Wasserstoffbrücke in den Antennen zusammenhängt. Im Gegensatz zu hGDH2 und hGDH1‑Mutanten hat eine Veränderung der Proteinkonzentration bei Wildtyp‑hGDH1 nur einen geringen Einfluss auf die spezifische Aktivität.