Peroxidase

Lactoperoxidase (EC 1.11.1.7, abgekürzt als LP oder LPO) ist ein Hämoprotein und eine Peroxidase, die in aus Tieren gewonnener Milch vorkommt. Lactoperoxidase, Wasserstoffperoxid und Thiocyanat können ein „Lactoperoxidase-System (LPS)“ bilden. Dieses Enzymsystem weist antibakterielle Aktivität auf, kann unter Bedingungen ohne Kühlung das Wachstum grampositiver und gramnegativer Bakterien hemmen, die Haltbarkeit von Frischmilch verlängern und wirkt als „Kaltsterilisation“. LPS in Milch hat nicht nur eine antibakterielle Wirkung, sondern verhindert auch die Anreicherung von Peroxiden, wodurch peroxidbedingte Zellschädigungen vermieden und die Brust geschützt werden.

Struktur

LP besteht aus einer Polypeptidkette mit 612 Aminosäureresten und ist ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 78 kDa und einem isoelektrischen Punkt von 9,6. LP enthält ein Häm (Methemoglobin) mit einem Eisengehalt von 0,07 % und einem Kohlenhydratgehalt von 10 %. Das Häm des katalytisch aktiven Zentrums besteht aus einem Protoporphyrin IX, das über eine Esterbindung kovalent an die Polypeptidkette gebunden ist. Studien zeigen, dass die Zerstörung von Disulfidbrücken in der LP-Struktur sowie das Vorhandensein bzw. Fehlen des Häms die Aktivität und Stabilität von LP direkt beeinflussen. LP ist ein häufiger Bestandteil von Human- und Kuhmilch. Es gehört zu den endogenen Enzymen, die in der Brustdrüse, Speicheldrüse, Tränendrüse und deren Sekreten (Milch, Speichel und Tränen) vorkommen. Die chemischen und immunologischen Eigenschaften von LP aus Brustdrüse, Speicheldrüse und Tränendrüse sind ähnlich.

Eigenschaften

LP ist Bestandteil des natürlichen Abwehrsystems des Wirts gegen eindringende Mikroorganismen. LP besitzt antibakterielle Aktivität, baut verschiedene Karzinogene ab und schützt tierische Zellen vor Peroxidation. LP ist eines der thermostabilen Enzyme in Milch; seine Inaktivierung wird als einer der Indikatoren für die Pasteurisation herangezogen. Die konventionelle Pasteurisation inaktiviert LP in Milch nicht, jedoch kann die thermische Stabilität von LP unter sauren Bedingungen (pH 5,3) vermindert sein, vermutlich aufgrund der Freisetzung von Calcium aus LP, was die thermische Stabilität maßgeblich beeinflusst. LP ist in Gegenwart von Riboflavin besonders lichtempfindlich.

Konzentration und Aktivität

In Kuhmilch ist LP nach Xanthinoxidase das zweithäufigste Enzym; die Konzentration beträgt etwa 30 mg/L. Es wurde berichtet, dass Veränderungen des LP-Gehalts mit Rasse, Reproduktionszyklus, Jahreszeit und Fütterungssystem der Rinder zusammenhängen. Zu beachten ist, dass – im Gegensatz zu anderen antibakteriellen Proteinen – der LP-Gehalt im Rinderkolostrum niedriger ist, jedoch nach der Geburt rasch ansteigt und nach 3–5 Tagen ein Maximum erreicht. Die LP-Aktivität unterscheidet sich je nach Milchquelle. Die durchschnittliche LP-Aktivität in Kuhmilch beträgt 2,3 U/mL; in Humanmilch ist sie geringer (0,67–0,97 U/mL); bei Meerschweinchen weist LP die höchste Aktivität auf und erreicht 22 U/mL. Es wurde berichtet, dass die Enzymaktivität von LP mindestens 0,02 U/mL betragen muss, um eine bakteriostatische Wirkung zu entfalten.

Lactoperoxidase-System

Das Lactoperoxidase-System (LPS) umfasst drei Komponenten, nämlich Lactoperoxidase, Thiocyanat (SCN¯) und Wasserstoffperoxid. Nur wenn diese drei Komponenten zusammenwirken, zeigt LPS antibakterielle Aktivität. In der praktischen Anwendung muss – sofern die Konzentration einer Komponente im System nicht ausreicht – diese zugesetzt werden, um die antibakterielle Wirkung sicherzustellen; dies wird als „Aktivierung“ des LPS bezeichnet. Dabei sollte die Konzentration der Lactoperoxidase nicht unter 0,02 U/mL liegen. Die Konzentration natürlicher LP in Kuhmilch beträgt 1,4 U/mL und erfüllt diese Anforderung. Thiocyanat ist in Geweben und Sekreten von Tieren weit verbreitet. Die Thiocyanatkonzentration in Milch beträgt jedoch nur 3–5 μg/mL und ist ein limitierender Faktor für die LPS-Aktivität. Es wurde berichtet, dass zur Aktivierung des LPS eine Thiocyanatkonzentration von etwa 15 μg/mL oder mehr erforderlich ist, sodass exogenes Thiocyanat zugesetzt werden muss. In frisch gemolkener Milch beträgt der Wasserstoffperoxidgehalt nur 1–2 μg/mL; für die Aktivierung des LPS werden 8–10 μg/mL Wasserstoffperoxid benötigt, sodass Wasserstoffperoxid extern zugeführt werden muss.

Katalytischer Mechanismus

Abbildung 1. Reaktionswege im durch Lactoperoxidase katalysierten Reaktionsmechanismus. (Seifu E. et al. 2005)

Die Peroxidation von H₂O₂ durch LP kann über drei unterschiedliche Zyklen erfolgen, was zu unterschiedlichen antimikrobiellen Aktivitäten führt:

A. In Anwesenheit ausreichender Mengen oxidierbarer Halogenide oder von SCN¯ als 2-Elektronen-Donor für Verbindung I, was zu einer optimalen Aktivierung von LP führt.

B. In Anwesenheit unzureichender Mengen an Halogeniden oder SCN¯ mit geeignetem Redoxpotenzial, wodurch 1-Elektronen-Donoren dominieren und es zur Akkumulation von Verbindung II sowie zu einer reversiblen Inaktivierung von LP kommt.

C. In Anwesenheit eines Überschusses an H₂O₂, was zur Bildung von Verbindung III führt und mit einer irreversiblen Inaktivierung von LP verbunden ist.

Antibakterielle Funktion

Die antibakteriellen Eigenschaften des LPS zeigen sich in einer bakteriostatischen oder bakteriziden Wirkung gegenüber bestimmten Mikroorganismen in Milch. Der antibakterielle Mechanismus besteht darin, dass Thiolgruppen in der Plasmamembran mikrobieller Zellen oxidiert werden, was zur Zerstörung der Membranstruktur sowie zum Austritt von Kaliumionen, Aminosäuren und Polypeptiden führt. Die Aufnahme von Glukose, Aminosäuren, Purinen und Pyrimidinen durch die Zellen sowie die Synthese von Proteinen, DNA und RNA werden gehemmt.

Unterschiedliche Bakterien weisen unterschiedliche Empfindlichkeiten gegenüber LPS auf. Gramnegative Bakterien wie Pseudomonas, Escherichia coli und Salmonella können nicht nur gehemmt, sondern auch abgetötet werden. Streptococcus und Milchsäurebakterien können nur gehemmt werden. Das Ausmaß der Beeinflussung durch LPS kann mit Unterschieden in Struktur und Eigenschaften der Zellmembran zusammenhängen. Die Zellmembran gramnegativer Bakterien ist durch LPS leichter zerstörbar als die Zellmembran grampositiver Bakterien. Dadurch treten Nährstoffe aus, die Nährstoffaufnahme der Bakterien wird beeinträchtigt, und letztlich kommt es zum Absterben oder zur Abnahme der Bakterienzahl.

Anwendung

Lactoperoxidase ist ein wirksamer antimikrobieller Wirkstoff und wird als antibakterielles Agens zur Reduktion der bakteriellen Mikroflora in Milch und Milchprodukten eingesetzt. Die Aktivierung des Lactoperoxidase-Systems durch Zusatz von Wasserstoffperoxid und Thiocyanat verlängert die Haltbarkeit gekühlter Rohmilch. Es ist relativ hitzebeständig und wird als Indikator für eine Überpasteurisation von Milch verwendet. Ein Lactoperoxidase-System gilt als geeignet zur Behandlung von Gingivitis und Parodontose. Lactoperoxidase wird in Zahnpasta oder Mundspüllösungen eingesetzt, um orale Bakterien und damit die von diesen Bakterien produzierte Säure zu reduzieren. Eine Kombination aus Lactoperoxidase, Glukose, Glukoseoxidase (GOD), Iodid und Thiocyanat gilt als wirksam zur Konservierung von Kosmetika. Antikörperkonjugate aus Glukoseoxidase und Lactoperoxidase wurden als wirksam bei der Abtötung von Tumorzellen in vitro beschrieben. Darüber hinaus werden Makrophagen, die Lactoperoxidase ausgesetzt sind, zur Abtötung von Krebszellen stimuliert.

Literatur