PNK

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Einführung

Polynukleotidkinase (Pnk) wurde von den Laboratorien von Richardson und Hurwitz in E. coli entdeckt, die mit T4- und T2-Bakteriophagen infiziert sind. Die Verwendung von Bakteriophage T4 Pnk zum Markieren von 5'DNA- oder RNA-Enden mit ³²P erleichtert die Entwicklung von Methoden zur Struktur von Nukleinsäuren, molekularer Klonierung und Nukleinsäure-Sequenzierung. Obwohl die Bedeutung von T4 Pnk in der rekombinanten DNA-Forschung gut bekannt ist, wird weniger häufig die Bedeutung seines Beitrags zum "RNA-Reparatur"-Weg in vivo gewürdigt. Während der T4-Infektion versucht das Bakterium, die T4-Proteinsynthese zu hemmen, indem es eine standortspezifische Spaltung von tRNAs in der Wirtszelle induziert, was dazu führt, dass das Phage Pnk und phage-kodierte RNA-Ligase verwenden, um die gebrochenen tRNAs zu reparieren. T4 Pnk katalysiert den Transfer von γ-Phosphat von ATP zum 5'OH-Terminus von RNA und die hydrolytische Entfernung des 3'PO₄ Terminus von RNA in diesem Weg. Eukaryotische tRNA-Spleißung erfordert eine Reihe ähnlicher Reaktionen. In Spalthefen und Metazoen spielen Pnk-Orthologe, die spezifisch für die Phosphorylierung von 5′ OH-DNA-Termini sind, eine wichtige Rolle bei der Reparatur von DNA-Schäden, die durch Oxidation, Strahlung und Topoisomerase-I-Gifte verursacht werden. Um ein tieferes Verständnis des Wirkmechanismus des Enzyms zu erlangen, sollten wir mehr Anstrengungen in die strukturelle Analyse investieren. 

Kristallstruktur der Kinase-Domäne

Die Wissenschaftler kristallisierten die N-terminale Kinase-Domäne Pnk (1-181), die ein kontinuierliches Peptid von Pnk-Resten 1 bis 152 enthält (der N-terminale His-Tag und das C-terminale Segment von Aminosäuren 153 bis 181 sind ungeordnet). Die Kinase-Domäne besteht aus viersträngigen parallelen β-Faltblättern (β2-β3-β1-β4), mit drei α-Helices auf jeder Seite. Die Helices α1, α5 und α6 befinden sich auf der linken Seite des β-Faltblatts, während α2, α3 und α4 auf der rechten Seite liegen. Diese Kinase enthält ein Konsensus-Walker-A-Box-Motiv (⁹GxxGxGKS¹⁶) zwischen der ersten β-Kette und der ersten α-Helix. Zwei Sulfationen binden an Pnk, von denen eines an die P-Schleife bindet und das andere an α2 und die Schleife, die β3 und α4 verbindet, um die NTP- und Phosphatrezeptor-Bindungsstellen zu trennen. Kinasen können in zwei Subdomänen unterteilt werden. Eine ist ein globularer Sockel, der die beiden Sulfate stützt; das andere bipartite Modul umfasst eine deckelartige Struktur über der Sulfat-Bindungsstelle. Das Kinase-Monomer kontaktiert ein anderes Monomer durch die kristallographische 2-fach-Achse, und die Oberfläche des Interaktionsinterfaces beträgt 2400 Ų (1200 Ų pro Protozoon). Die molekularen Kontakte an der Schnittstelle sind hauptsächlich hydrophob.

Abbildung 1. Struktur der 5′-Kinase-Domäne. Ein Stereo-Ribbon-Bild wird gezeigt, mit dem zentralen β-Faltblatt in grün und flankierenden α-Helices in lila (Wang, L.K.; et al. 2002)

Pnk aktive Stelle

Die beiden Sulfationen spielen eine wichtige Koordinationsrolle innerhalb der Tertiärstruktur von Pnk. Insbesondere hat das erste Sulfat umfangreiche Kontakte mit den Rückgrat-Aminstickstoffatomen der P-Schleife und mit den Seitenketten der Reste Lys15 und Ser16. Wissenschaftler spekulieren, dass dieses Sulfat die NTP-Bindungsstelle von Pnk definiert. Arg126 kann funktionell nicht durch Lysin ersetzt werden, was die Bedeutung der bidentaten Wechselwirkung mit dem NTP-Substrat hervorhebt. Arg126 ist Teil der Deckel-Subdomäne, die die NTP-Bindungsstelle abdeckt und befindet sich innerhalb des Motivs ¹²²RxxxR¹²⁶. Das zweite Sulfation ist 8,5 Å vom ersten Sulfation entfernt und ist koordiniert mit dem Hauptketten-Aminstickstoff und der Seitenkette Oγ von Thr86 sowie mit beiden terminalen Guanidinnitrogen von Arg38. Die Seitenkette von Arg38 ist sehr wichtig für die Phosphorylierung von 3'CMP. Mutationsanalysen zeigten, dass der Kontakt des Sulfats (3' Phosphat) mit dem Hauptketten-Amin von Thr86 unerlässlich sein könnte, insofern als die benachbarte Asp85-Seitenkette durch Alanin ersetzt wurde, was zu einem Funktionsverlust führte. Asp85 bildet eine bidentate Wasserstoffbrücke mit dem Hauptketten-Amin von Arg34 und dem Seitenketten-Aminstickstoff von Gln64, sodass Thr86-NH in der richtigen Position fixiert werden kann, um das Substrat zu binden. Ein Aspartat ist an der entsprechenden Position (Asp93) von CPT konserviert.

Abbildung 2. Pnk aktive Stelle (Wang, L.K.; et al. 2002)