PNK

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Einleitung

Die Polynukleotidkinase (Pnk) wurde in den Laboratorien von Richardson und Hurwitz in mit den Bakteriophagen T4 und T2 infizierten E. coli entdeckt. Die Markierung von 5′-DNA- oder RNA-Enden mit ³²P unter Verwendung der Bakteriophagen‑T4‑Pnk erleichtert die Entwicklung von Methoden zur Analyse der Nukleinsäurestruktur, des molekularen Klonierens und der Nukleinsäuresequenzierung. Obwohl die Bedeutung der T4‑Pnk in der rekombinanten DNA‑Forschung weithin bekannt ist, wird ihr Beitrag zum „RNA‑Repair“-Signalweg in vivo weniger häufig gewürdigt. Während einer T4‑Infektion versucht das Bakterium, die T4‑Proteinsynthese zu hemmen, indem es eine ortsspezifische Spaltung von tRNAs in der Wirtszelle induziert; der Phage nutzt daraufhin Pnk und eine phagenkodierte RNA‑Ligase, um die gespaltenen tRNAs zu reparieren. In diesem Signalweg katalysiert T4‑Pnk die Übertragung des γ‑Phosphats von ATP auf das 5′‑OH‑Ende von RNA sowie die hydrolytische Entfernung des 3′‑PO₄‑Endes von RNA. Das eukaryotische tRNA‑Spleißen erfordert eine Reihe ähnlicher Reaktionen. In Spalthefen und Metazoen spielen Pnk‑Orthologe, die spezifisch die Phosphorylierung von 5′‑OH‑DNA‑Termini katalysieren, eine wichtige Rolle bei der Reparatur von DNA‑Schäden, die durch Oxidation, Strahlung und Topoisomerase‑I‑Gifte verursacht werden. Um den Wirkmechanismus des Enzyms besser zu verstehen, sollten weitere Anstrengungen in der Strukturanalyse unternommen werden. 

Kristallstruktur der Kinase‑Domäne

Die Wissenschaftler kristallisierten die N‑terminale Kinase‑Domäne von Pnk (1–181), die ein kontinuierliches Peptid aus den Pnk‑Resten 1 bis 152 enthält (der N‑terminale His‑Tag und das C‑terminale Segment der Aminosäuren 153 bis 181 sind ungeordnet). Die Kinase‑Domäne besteht aus viersträngigen parallelen β‑Faltblättern (β2‑β3‑β1‑β4) mit jeweils drei α‑Helices auf jeder Seite. Die Helices α1, α5 und α6 befinden sich auf der linken Seite des β‑Faltblatts, während α2, α3 und α4 auf der rechten Seite lokalisiert sind. Diese Kinase enthält ein konserviertes Walker‑A‑Box‑Motiv (⁹GxxGxGKS¹⁶) zwischen der ersten β‑Strangregion und der ersten α‑Helix. An Pnk sind zwei Sulfationen gebunden, von denen eines an die P‑Schleife bindet und das andere an α2 sowie an die Schleife, die β3 und α4 verbindet, wodurch die Bindungsstellen für NTP bzw. Phosphat‑Akzeptor voneinander getrennt werden. Kinasen lassen sich in zwei Subdomänen unterteilen. Die eine ist ein globuläres „Podest“, das die beiden Sulfate trägt; die andere, bipartite Modulstruktur umfasst eine deckelartige („lid“) Struktur oberhalb der Sulfat‑Bindungsstelle. Das Kinase‑Monomer steht über die kristallographische zweizählige Achse mit einem weiteren Monomer in Kontakt; die Oberfläche der Interaktionsschnittstelle beträgt 2400 Ų (1200 Ų pro Protomer). Die molekularen Kontakte an der Grenzfläche sind überwiegend hydrophober Natur.

Abbildung 1. Struktur der 5′‑Kinase‑Domäne. Dargestellt ist eine Stereo‑Bänderdarstellung mit dem zentralen β‑Faltblatt in Grün und den flankierenden α‑Helices in Violett (Wang, L.K.; et al. 2002)

Aktives Zentrum von Pnk

Die beiden Sulfationen übernehmen eine wichtige koordinierende Funktion innerhalb der Tertiärstruktur von Pnk. Insbesondere weist das erste Sulfat umfangreiche Kontakte zu den Amidstickstoffen des Peptidrückgrats der P‑Schleife sowie zu den Seitenketten der Reste Lys15 und Ser16 auf. Die Wissenschaftler vermuten, dass dieses Sulfat die NTP‑Bindungsstelle von Pnk definiert. Arg126 kann funktionell nicht durch Lysin ersetzt werden, was die Bedeutung einer bidentaten Wechselwirkung mit dem NTP‑Substrat unterstreicht. Arg126 ist Teil der Lid‑Subdomäne, die die NTP‑Bindungsstelle überdeckt, und liegt innerhalb des Motivs ¹²²RxxxR¹²⁶. Das zweite Sulfation ist 8,5 Å vom ersten Sulfation entfernt und wird durch den Amidstickstoff des Hauptketten‑Backbones sowie das Oγ der Seitenkette von Thr86 und durch beide terminalen Guanidin‑Stickstoffe von Arg38 koordiniert. Die Arg38‑Seitenkette ist für die Phosphorylierung von 3′CMP von großer Bedeutung. Mutationsanalysen zeigten, dass der Kontakt des Sulfats (3′‑Phosphat) mit dem Hauptketten‑Amid von Thr86 unverzichtbar sein könnte, da der Austausch der benachbarten Asp85‑Seitenkette gegen Alanin zu einem Funktionsverlust führte. Asp85 bildet eine bidentate Wasserstoffbrücke mit dem Hauptketten‑Amid von Arg34 und dem Amidstickstoff der Seitenkette von Gln64, wodurch Thr86‑NH in der korrekten Position fixiert werden kann, um das Substrat zu binden. Ein Aspartat ist an der entsprechenden Position (Asp93) von CPT konserviert.

Abbildung 2. Aktives Zentrum von Pnk (Wang, L.K.; et al. 2002)