Tannase

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Tannase (EC 3.1.1.20) gehört zur Klasse der Hydrolasen. Es katalysiert die Hydrolyse von Digallat zu Gallat. Der systematische Name dieser Enzymklasse ist Tannin-Acylhydrolase. Weitere gebräuchliche Namen sind Tannase S und Tannin-Acetylhydrolase. Tannase ist eine natürliche adaptive intrazelluläre/extrazelluläre induzierbare Hydrolase und gehört zur Esterase-Superfamilie. Tannase kann aus Pflanzen, Tieren und Mikroorganismen gewonnen werden, aber die mikrobiell abgeleitete Tannase ist umfangreicher, da ihre Stabilität höher ist als die von pflanzlichen und tierischen Quellen.

Struktur

Die natürliche B. subtilis Tannase besteht aus 9,3% α-Helix, 33,6% parallelem β-Faltblatt, 17,2% β-Wendung und 39,9% zufälliger Coil. Die β Konformation spielt eine dominante Rolle in der Tannase-Aktivität, und die Sekundärstruktur der Tannase ist streng abhängig von ihrem Mikroenvironment (Temperatur und pH). Die Scanning-Probenmikroskopie-Analyse (SPM) der B. subtilis Tannase zeigte, dass die Tannase unterschiedliche Grade der Aggregation aufwies, die Struktur ähnelt einer runden oder ovalen Form, die Größe variiert, und der durchschnittliche Durchmesser beträgt 44 nm. Die Kristallstruktur der Tannase ist ein kleines plattiges Kristall. Die dreidimensionale strukturelle Analyse der L. plantarum Tannase ergab, dass sie eine α/β-Struktur mit 18 α-Helices und 13 β-Strängen aufweist.

Abbildung 1. Kristallstruktur (a) und dreidimensionales Band der L. plantarum Tannase (b). (Jana A. 2014)

Physikochemische Eigenschaften

Die Eigenschaften der Tannase variieren von Art zu Art. Tannase hat ein Molekulargewicht von 46,5-90 kDa und existiert als Monomer, während die Tannase von Rhodococcus sp. und L. plantarum zwei Untereinheiten enthält. Bisher sind alle Tannasen aus Hefen und Pilzen Glykoproteine, aber es scheint keine solche posttranslationalen Modifikation in Bakterien zu geben. Tannase ist ein sauberes Protein mit einem optimalen pH-Bereich von 4,5-7,0. Die optimale Temperatur verschiedener Arten von Tannase ist unterschiedlich, und die optimale Temperatur der meisten bakteriellen Tannasen liegt zwischen 30 und 40 °C. Wenn Methylgallat als Substrat verwendet wird und die Reaktionstemperatur 30-40 °C beträgt, betrug die Substrataffinität (Km) der bakteriellen Tannase von Selenomonas ruminantium und Enterobacter sp. 1,6 bzw. 3,7. Mehr als 28% der bakteriellen Tannase benötigt Metallionen als Cofaktor, um ihre maximale katalytische Effizienz zu stimulieren. Es wurde auch festgestellt, dass die Aktivität der B. subtilis Tannase in polaren protischen Lösungsmitteln wie Glycerin, Isopropanol, Ethanol, Methanol und Isoamylalkohol erhöht wird, während Butanol, Essigsäure und Aceton die Aktivität der Tannase verringern.

Katalytischer Mechanismus

Tannase ist das am meisten untersuchte Enzym im Tannin-Biodegradationsprozess. Es katalysiert die Hydrolyse von Estern und Depsidbindungen verschiedener Substrate, einschließlich Gallanonen, Gallussäureestern, Epigallocatechingallat und Epicatechingallat, wobei Gallussäure und Glukose freigesetzt werden. Die L. plantarum Tannase besteht aus zwei Domänen, einer α/β-Hydrolase-Domäne (Reste 4-204 und 396-469) und einer "Deckel"-Domäne (Reste 205-395). Das Glycerinmolekül in der Kryoprotektantlösung bindet an die aktive Stelle der Tannase, die die Bindung der Galloylgruppe an ihr Substrat nachahmt. Die aktive Stelle der Tannase befindet sich in der α/β-Hydrolase-Domäne, von der drei Aminosäurereste Ser163, Asp419 und His451 katalytische Triaden sind. Die L. plantarum Tannase enthält 18 α-Helices und 13 β-Stränge, und Ser163 ist im Gly161-X-Ser163-X-Gly165-Pentapeptid-Motiv zwischen β6 und α6 vorhanden. An der aktiven Stelle bildet Ser163 eine Wasserstoffbrücke mit dem NE2-Atom des His451-Imidazolrings. Während der Reaktion deprotonierte His451 die Hydroxylgruppe von Ser163, und Ser163 wurde durch Wasserstoffbrückenbindung mit Asp419 stabilisiert.

Abbildung 2. Aktive Stelle (e) und katalytische Triadregion der L. plantarum Tannase (f). (Jana A. 2014)

Anwendung

Tannase beteiligt sich an der Fruchtreifung, indem sie die Esterbindungen von Glukose mit Chebulinsäure, Gallussäure und Hexahydrophenolsäure bricht. Tannase wird auch in der Lebensmittel-, Futtermittel-, Getränke-, Pharma- und Chemieindustrie verwendet, um Gallussäure, Instanttee, kaffeehaltige Erfrischungsgetränke und Eichelweine herzustellen. Darüber hinaus wird Tannase verwendet, um Bier und Saft zu klären, den Geschmack des Weins zu verbessern und Tierfutter herzustellen. In der chemischen Industrie kann Tannase zur analytischen Probenvorbereitung, zur Bestimmung der Struktur von natürlich vorkommenden Gallussäureestern, zur Erkennung von Krebszellen und zur Behandlung von tanninhaltigem Abwasser in der Olivenöl- und Lederindustrie eingesetzt werden.

Literaturverzeichnis

1. Jana, A., Halder, S.K., Banerjee, A., Paul, T., Pati, B.R., Mondal, K.C., Mohapatra, P.K.D. Biosynthesis, structural architecture and biotechnological potential of bacterial tannase: A molecular advancement. Bioresource Technology, 2014, 157:327–340.
2. Rivas, B., Rodríguez, H., Anguita, J., Muñoz, R. Bacterial tannases: classification and biochemical properties. Appl Microbiol Biotechnol, 2019, 103(2):603-623.