Carboanhydrase

Die Carboanhydrase (CA) ist ein zinkhaltiges Metalloenzym. Bislang wurden bei Säugetieren mindestens acht Isoenzyme identifiziert. Struktur, Verteilung und Eigenschaften unterscheiden sich und stehen im Zusammenhang mit der Sekretion von H⁺ und Bicarbonat aus verschiedenen Epithelzellen. Die Carboanhydrase katalysiert die Hydratationsreaktion von CO₂ sowie einige Hydratationsreaktionen von Lipiden und Aldehyden und ist an verschiedenen Ionenaustauschprozessen beteiligt, um die Homöostase des Organismus aufrechtzuerhalten.

Verteilung

CA ist weit verbreitet. CAI und CAII wurden erstmals aus Erythrozyten isoliert. CAIII wurde zunächst im Zytoplasma der Skelettmuskulatur nachgewiesen; alle drei weisen beim Menschen eine Molekülmasse von 29 kD auf. Die membranassoziierte CAIV wurde aus Kälberlunge, menschlicher Niere und Rattenlunge gereinigt. CAIV (29 kD) wurde in Mitochondrien nachgewiesen; CAVI (42 kD), aus Speicheldrüsen gereinigt, ist ein sezerniertes Enzym.

Das neu identifizierte, CA-assoziierte Gen CAVIII, das kürzlich in Speicheldrüsen und in Purkinje-Zellen des Kleinhirns entdeckt wurde, kodiert ebenfalls für ein intrazytoplasmatisches Enzym. Im Gastrointestinaltrakt, in den distalen Nierentubuli und Sammelrohren, in Zellen der Nebennierenrinde, in Stenosezellen am Beginn des Nebenhodens, in distalen Kopf- und proximalen Schwanzepithelzellen, in schnell kontrahierenden Skelettmuskelzellen, in Epithelzellen des Plexus choroideus, in phospholipidproduzierenden Markzellen sowie in Ziliarfortsätzen des Auges, in Hornhaut- und Netzhautzellen ist jeweils CAII nachweisbar. CAIV ist ebenfalls im Gastrointestinaltrakt, in distalen Nierentubuli sowie im aufsteigenden Schenkel der Markregion an apikalen und lateralen Plasmamembranoberflächen verteilt, ferner in den Mikrovilli des Epithels des Ductus deferens und seiner Ampulle, an der apikalen Plasmamembran, in der subkutanen glatten Muskelschicht, an der Oberfläche von Hirnkapillar-Endothelzellen, im Myokard, im Kapillarbett des Auges, in der Aderhaut-Gefäßschicht sowie in Skelettmuskel, Leber, Tränendrüse etc..

Molekulare Struktur

In den aktiven Zentren von CAI, CAII und CAIII befindet sich jeweils ein Zinkatom; CAI und CAII liegen als Monomere vor, während CAIII als über Disulfidbrücken verknüpftes Dimer existiert. Die dreidimensionalen Strukturen der humanen CAI und CAII sind anhand der Röntgenkristallographie nahezu identisch. Die Aminosäuresequenzen von CAI und CAII weisen etwa 60 % Homologie auf. CAIV besteht aus 260 Aminosäuren und ist über Phosphatidylinositol-Glycerol-Bindungen in der Plasmamembran verankert. Es ist gegenüber SDS-Dissoziation resistent und zeigt eine Homologie von 30 % bis 36 % zu zytosolischen CAs. Die Struktur variiert zwischen den Spezies. Humane Lungen-CAIV (36 kD) weist keine N-glykosidisch gebundenen Oligosaccharidketten auf, während murine Lungen-CAIV (39 kD) und die meisten anderen Säugetiere diese Ketten überwiegend besitzen. CAVI verfügt über zwei Oligosaccharidketten, die in der rekombinanten Form vorhanden sind.

Biologische Funktionen

Beteiligung am Hydratationsprozess von CO₂: CAII katalysiert reversibel die Hydratationsreaktion von CO₂. Der spezifische Prozess lautet: CO₂ + H₂O → H₂CO₃ → HCO₃^- + H⁺. Die strukturelle Auflösung der CAII im menschlichen Blut konnte bis auf 1,54 × 10^-10 m bestimmt werden; dabei zeigt sich, dass das katalytisch aktive Struktur-Zn in einer Spalte in 1,5 × 10^-10 m Tiefe lokalisiert ist. Zn bildet zusammen mit den drei Stickstoffatomen der Imidazol-Seitenkette von Histidinresten sowie dem Sauerstoffatom der katalytisch aktiven nukleophilen OH^--Gruppe der CA ein Polyeder mit einem vierwertigen Metallzentrum. Die aktive Region enthält einen wichtigen polaren Rest, T199, der eine Wasserstoffbrücke von einem an Zn gebundenen Hydroxid akzeptieren kann und zudem eine Wasserstoffbrücke zu E106 bereitstellt. H64 fungiert als Protonen-„Shuttle“, das an Zn gebundenes Wasser in Hydroxid umwandelt. In der Region benachbart zum an Zn gebundenen OH^- befindet sich eine hydrophobe Kavität, die als prä-katalytische Bindungsregion für das CO₂-Substrat angenommen wird; auch der einzige kompetitive Inhibitor der CO₂-Hydratationsreaktion kann hier binden.

Phosphataseaktivität: CAIII zeigt Phosphataseaktivität, gemessen mit einer Nitrophenylgruppe. Bei Säugetieren kann CAIII glutathionyliert werden, d. h. die beiden Cysteine des Glutathions werden über Disulfidbrücken verknüpft; dieser Prozess ist reversibel. Ist Cys186 an diesem Prozess beteiligt, weist CAIII Phosphataseaktivität auf. Ist Cys181 beteiligt, verliert CAIII die Phosphataseaktivität. Der Glutathionylierungsprozess aktiviert die Phosphataseaktivität von CAIII. Unter oxidativem Stress ist die Glutathionylierung verstärkt, die CAIII-Phosphataseaktivität erhöht und spielt eine Rolle in der zellulären Signaltransduktion.

Aktivitätsregulation

Abbildung 1. Katalytische Mechanismen sowie Hemm- und Aktivierungsmechanismen von CAI. (Supuran C.T. 2016)

Die wichtigsten Inhibitoren der CA sind Sulfonamide. Die hemmende Wirkung von Tensiden wie DDT auf CA könnte mit einer erleichterten Dissoziation von Gruppen zusammenhängen. Unterschiedliche CAs weisen eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber Sulfonamid-Inhibitoren auf. Die Bindungsfähigkeit von CAII-Varianten an Position 198 und von Inhibitoren wurde untersucht. Dabei zeigte sich, dass Ladung, Hydrophobizität und Wirkstoffaffinität der Seitenkette des Restes 198 mit der Phenylalanin-Seitenkette bei CAII I198 zusammenhängen. Die Phenylgruppen packen hydrophobe „Taschen“ aus, was zu niedriger Katalyse und geringer Sensitivität führt. Darüber hinaus kann ein Tensid bei hohen CA-Konzentrationen die Polymerbildung hemmen, wodurch die kompetitive Hemmung des Polymers bei der Bildung von CA-Refolding-Protein reduziert wird; dies fördert die Initiationsphase des Protein-Refoldings und erweitert letztlich den Konzentrationsbereich der CA-Aktivität.

Es wurde gezeigt, dass Estradiol (E2) einen gewissen Einfluss auf CA hat, wobei die Wirkung gewebespezifisch variiert: CA in der Duodenalschleimhaut von Ratten kann unter E2 eine verminderte Aktivität aufweisen, während die CA der Rattenniere zwar unter E2 eine abnehmende Tendenz zeigte, jedoch ohne signifikanten Unterschied. Zudem wurde festgestellt, dass der CAII-Protein- und mRNA-Spiegel in der Paraprostata kastrierter Ratten vermindert war, während er auf der dorsalen Seite umgekehrt war. Diese Veränderung war nach Testosteronbehandlung reversibel, kehrte sich nach Behandlung entsprechend den Veränderungen der lateralen Seite um und hatte keinen Einfluss auf die dorsale Seite. Die Behandlung nicht kastrierter Ratten zeigte, dass der dorsale CAI-Spiegel anstieg, während sich der laterale CAII-Spiegel nicht veränderte. Die Grundstruktur, die allgemeine Verteilung und die grundlegenden physiologischen Funktionen der Carboanhydrase sind bereits seit den 1960er-Jahren bekannt. Mit den Methoden der Molekularbiologie fokussierte sich die breite Anwendung der jüngeren Forschung auf die Untersuchung des Zusammenhangs zwischen Struktur und Funktion der CA. Das Verständnis von Struktur, Funktion und Verteilung der CA wird weiter konkretisiert werden.

Klinische Anwendung

CA katalysiert in den Epithelzellen des Ziliarkörpers die Bildung von HCO₃ aus CO₂ und H₂O und wird über die luminale Membran in das Kammerwasser sezerniert. Da die Flüssigkeit im Kammerwasser elektrisch neutral gehalten wird, ist die Sekretion von Na⁺ in das Kammerwasser erhöht und Cl^- wird in das Kammerwasser verlagert, wodurch ein hoher osmotischer Druck im Kammerwasser entsteht, der anschließend den Einstrom von H₂O in das Kammerwasser fördert. Bei Glaukompatienten führt ein unzureichender Abfluss des Kammerwassers zu einem erhöhten intraokularen Druck. Carboanhydrase-Inhibitoren (CAIs) hemmen die Aktivität der CA, reduzieren die Bildung von HCO₃ und senken den intraokularen Druck; sie werden klinisch zur Behandlung des Glaukoms und zur Senkung des Augeninnendrucks eingesetzt. CAIs als Arzneimittel zur Glaukomtherapie werden entsprechend ihrer Entwicklung und pharmakologischen Wirkung in drei Generationen eingeteilt: orale CAIs der ersten Generation, topische CAIs der zweiten Generation und langwirksame, nicht reizende topische CAIs der dritten Generation.

Literatur