Fpg-Protein

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Biochemie von Fpg

Fpg (EC 3.2.2.23), auch bekannt als 8-oxoguanin-DNA-Glykosylase oder MutM, ist eines der wichtigsten Enzyme im bakteriellen BER-Weg. Fpg schützt DNA vor der Ansammlung von 8-oxoguanin (8-oxoG), das dazu neigt, eine energetisch günstige syn-Konformation anzunehmen, wodurch ein Hoogsteen-Typ-Basenpaar mit Adenin gebildet wird. Die Addition von dAMP gegenüber 8-oxoG während der Replikation führt zu einer G→T Transversion. Fpg hat mehrere enzymatische Aktivitäten. Es wirkt als Glykosylase/AP-Lyase, die für die Entfernung beschädigter Basen verantwortlich ist, gefolgt von der Spaltung des DNA-Rückgrats an der Schadensstelle durch β-Elimination.

Aber Fpg unterscheidet sich von den meisten anderen Glykosylasen/AP-Lyasen durch seine Fähigkeit, zwei aufeinanderfolgende Eliminationsschritte durchzuführen (oft als "β-Elimination" und "δ-Elimination" bezeichnet, um sie zu unterscheiden). Somit ist das Endprodukt der Fpg-Aktion eine einzelne Nukleotid-Lücke in der DNA, flankiert von zwei Phosphatgruppen. Darüber hinaus wirkt Fpg als Deoxyribophosphodiesterase-Lyase, die die Entfernung von Deoxyribose-5’-phosphat von nickten abasischen (AP) Stellen in der DNA katalysiert. Ein kovalentes Imin (Schiff-Basis) wird zwischen dem Enzym und dem C1’ des beschädigten Nukleotids als Zwischenprodukt in dieser katalytischen Reaktion gebildet, das mit Natriumborhydrid reduziert werden kann, um einen stabilen kovalenten Fpg-DNA-Komplex zu bilden. Neben 8-oxoG und FaPy-Läsionen schneidet Fpg auch viele andere modifizierte Purine und möglicherweise einige oxidierte Pyrimidine aus.

Strukturen von Fpg-Proteinen aus verschiedenen Bakterienarten

Strukturelle Daten für Fpg-Proteine aus E. coli (Eco-Fpg), Lactococcus lactis, Bacillus stearothermophilus und Thermus thermophilus sind derzeit verfügbar. Th. thermophilus Fpg wurde als unkomplexiertes Protein gelöst, während andere Fpg-Proteine analysiert wurden, die an DNA gebunden sind, aber diese Proteinstrukturen waren insgesamt recht ähnlich.

Fpg besteht aus N-terminalen und C-terminalen Domänen, die durch Scharnier-Polypeptide verbunden sind. Die N-terminale Domäne enthält die aktive Stelle für die Bildung der Schiff-Basis, in der Pro-1 als Nucleophil wirkt. Die C-terminale Domäne enthält einen einzelnen Zinkfinger, der für die Bindung an beschädigte DNA erforderlich ist. Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung der Fpg-DNA-Interaktion aus Röntgendaten.

Ähnlich wie die meisten anderen DNA-Glykosylasen dreht Fpg das beschädigte Nukleotid aus der DNA in die tiefe aktive Stelle. Um die verwaisten, gegenüberliegenden Cytosinreste (C⁽⁰⁾) zu erkennen, klemmt das Enzym den Arylring von Phe-110 in den Raum zwischen C⁽⁰⁾ und der benachbarten Base (C⁽¹⁾) und macht Gesicht-zu-Gesicht-Interaktionen mit dem Pyrimidinring von C⁽¹⁾, wodurch die beiden Basen entstapelt werden. C⁽⁰⁾ bleibt intra-Helix und wird durch Wasserstoffbrücken zwischen C⁽⁰⁾ und O² sowie N3 von Arg-108 stabilisiert.

Abbildung 1. Schema der Fpg-DNA-Interaktionen (Zharkov, D.O. et al. 2003)

Beitrag struktureller Elemente der DNA zur Fpg-Bindung

Die von Fpg induzierten unspezifischen DNA-Anpassungen an die katalytisch optimale Konformation konnten in Stoppfluss-Experimenten nicht nachgewiesen werden. Für viele DNA-abhängige Enzyme sind diese Anpassungen und die anschließenden katalytischen Schritte am empfindlichsten gegenüber der Natur der DNA. Jedes Enzym stimmt die DNA-Konformation auf seine eigene Weise ab, oft unter Einbeziehung des Schmelzens von DNA-Fragmenten, oft begleitet von konformationellen Änderungen im DNA-Rückgrat und teilweiser oder vollständiger Basenentpackung. Die Bildung strukturell definierter Wasserstoffbrücken zwischen Enzymen und spezifischen DNA-Basen ist eine der letzten Phasen der Substratauswahl. Die Bildung dieser Bindungen gewährleistet die richtige Orientierung der spezifischen Basen in der aktiven Stelle des Enzyms und beschleunigt die Reaktion um 4-7 Größenordnungen.

Der Anstieg der Affinität beim Übergang von unspezifischen zu spezifischen ds ODNs hängt bis zu einem gewissen Grad von der DNA-Sequenz ab. Die Affinität für spezifische Hetero-ODNs ist 50-75-fach höher als die Affinität für d(pT)_14-15•d(pA)_14-15. Ein relativer Beitrag der spezifischen Interaktion von Fpg mit 8-oxoG ist auf allen Ebenen vergleichbar (für minimale Liganden, ss und ds ODNs), was impliziert, dass spezifische und unspezifische Interaktionen der einzelnen Nukleotide der DNA zu ihrer Gesamtaffinität für Fpg nahezu additiv sind. Fpg erkennt freie dNMPs durch grundlegende additive Interaktionen mit ihren strukturellen Elementen, wobei die Hauptbeiträge von der Phosphatgruppe stammen. Prinzipiell wird keine absolute Additivität für Liganden erwartet, die verschiedene strukturelle Elemente von dNMPs annähern. Fpg ist in der Lage, Mononukleotid-Einheiten innerhalb der DNA und als freie dNMPs in nahezu additiver Weise mit vergleichbarer Affinität zu erkennen. Zusammenfassend kann die Interaktion von Fpg mit spezifischer DNA unter Verwendung des in Abbildung 2 gezeigten Modells approximiert werden.

Abbildung 2. Thermodynamisches Modell der Interaktionen von Fpg mit spezifischer DNA (Zharkov, D.O. et al. 2003)