GOTT

Glucoseoxidase (GOD) ist ein wichtiges industrielles Enzym in der Lebensmittelindustrie. Der systematische Name der Glucoseoxidase lautet β-D-Glucose-Oxidoreduktase (EC 1.1.3.4). Sie wird широко zur Deoxygenierung von Wein, Bier, Fruchtsäften und Milchpulver eingesetzt sowie zur Mehlverbesserung, zur Verhinderung von Bräunungsreaktionen, für Schnellnachweise in Lebensmitteln und in Biosensoren. Glucoseoxidase ist in Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen weit verbreitet. Aufgrund der schnellen Vermehrung und der breiten Verfügbarkeit mikrobieller Quellen ist das mikrobielle Wachstum die wichtigste Quelle für die Produktion von Glucoseoxidase. Die wichtigsten Produktionsstämme sind Aspergillus niger und Penicillium.

Struktur

Glucoseoxidase ist ein homodimeres Molekül mit zwei Bindungsstellen für Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD). Jedes Monomer umfasst zwei unterschiedliche Bereiche: einen Bereich, der nicht-kovalent, jedoch fest an einen Teil des FAD gebunden ist und überwiegend aus β-Faltblattstrukturen besteht; sowie einen zweiten Bereich, der an das Substrat β-D-Glucose bindet und durch vier α-Helices mit einem antiparallelen β-Faltblatt stabilisiert wird.

Eigenschaften

Hochreine Glucoseoxidase liegt als hellgelbe Kristalle vor, ist in Wasser löslich und in organischen Lösungsmitteln wie Ether, Chloroform, Butanol, Pyridin, Glycerol und Ethylenglykol unlöslich. Die relative Molekülmasse der Glucoseoxidase beträgt etwa 1,5 × 10⁵. Der pH-Bereich liegt bei 3,5 bis 6,5, das pH-Optimum bei etwa 5,0. Der Temperaturbereich liegt im Allgemeinen bei 30 bis 60℃, die optimale Temperatur bei 50 bis 55℃. Glucoseoxidase bindet mit hoher Spezifität an β-D-Glucopyranose. Die Hydroxylgruppe am C1-Atom der Glucose ist für die Katalyse erforderlich; die Aktivität der Glucoseoxidase ist etwa 160-fach höher, wenn sich die Hydroxylgruppe in β-Position statt in α-Position befindet. Die Aktivität der Glucoseoxidase wird stark reduziert, wenn sich die molekulare Struktur des Substrats an den Positionen C1, C2, C3, C4, C5 oder C6 verändert. Gegenüber L-Glucose und 2-O-Methyl-D-Glucose ist Glucoseoxidase vollständig inaktiv.

Katalytischer Mechanismus

Glucoseoxidase kann molekularen oder atomaren Sauerstoff verbrauchen, um Glucose zu oxidieren, und schützt dadurch leicht oxidierbare Bestandteile in Lebensmitteln. Abhängig von den Reaktionsbedingungen gibt es zwei Formen der durch Glucoseoxidase katalysierten Reaktion.

(1) Ohne Katalase: Glucoseoxidase katalysiert die Oxidation von β-D-Glucose zu D-Glucono-δ-lacton unter gleichzeitiger Freisetzung von Wasserstoffperoxid.

(2) In Anwesenheit von Katalase: Zunächst katalysiert Glucoseoxidase die Oxidation von β-D-Glucose zu D-Glucono-δ-lacton und Wasserstoffperoxid. Anschließend katalysiert Katalase den Abbau von Wasserstoffperoxid zu Wasser und Sauerstoff. Schließlich reagiert Wasser mit D-Glucono-δ-lacton zu Gluconsäure.

(3) In Anwesenheit von Katalase und Ethanol: Zunächst katalysiert Glucoseoxidase die Oxidation von β-D-Glucose zu D-Glucono-δ-lacton und Wasserstoffperoxid. Anschließend katalysiert Katalase die Reaktion von Wasserstoffperoxid mit Ethanol zu Wasser und Acetaldehyd. Schließlich reagiert Wasser mit D-Glucono-δ-lacton zu Gluconsäure.

Herstellung

Derzeit erfolgt die industrialisierte Herstellung von Glucoseoxidase mittels mikrobieller Fermentation. Die Mikroorganismen, die Glucoseoxidase produzieren können, sind hauptsächlich Bakterien und Schimmelpilze. In der Glucoseoxidase-Industrie werden häufig UV-Mutagenese und chemische Mutagenese von Produktionsstämmen eingesetzt. Zur Selektion positiver Mutantenstämme zur Steigerung der Enzymproduktionsleistung kann eine einzelne Mutagenesemethode oder eine Kombination mehrerer Methoden verwendet werden. In der industriellen Produktion werden üblicherweise Fermentationen mit Aspergillus niger oder Penicillium eingesetzt, um Glucoseoxidase zu gewinnen. Während der Fermentation von Aspergillus niger und Penicillium werden jedoch häufig auch andere Begleitproteine wie Katalase gebildet, was die Abtrennung und Reinigung der Glucoseoxidase erschwert. Daher steht die Konstruktion besser geeigneter Stämme mittels Gentechnik seit Langem im Fokus der Forschung in verschiedenen Ländern. Durch Induktion der Expression des Glucoseoxidase-Gens kann eine große Menge an Glucoseoxidase-Protein gewonnen werden. Da gentechnisch veränderte Organismen nur geringe Mengen endogener Proteine sekretieren, befinden sich in der Matrix überwiegend exogene Proteine, was die nachgelagerte Proteinreinigung vereinfacht.

Anwendungen

In der Lebensmittelindustrie wird Glucoseoxidase hauptsächlich in den folgenden fünf Bereichen eingesetzt: Deoxygenierung, Mehlverbesserung, Glucose, Glucosegehalt und Sterilisation. Darüber hinaus ist Glucoseoxidase ein neuartiger enzymatischer Futtermittelzusatzstoff, der das intestinale Milieu von Tieren verbessern, die Verdauung der Ration regulieren und das Wachstum fördern kann. Ein Mischfuttermittelzusatzstoff, der Glucoseoxidase, Milchsäureperoxid und Lactoferrin enthält, kann zur Prävention gastrointestinaler Infektionen und Durchfallerkrankungen bei Nutztieren eingesetzt werden. Da Glucoseoxidase die Bildung von Gluconsäure und Wasserstoffperoxid aus intestinaler Glucose katalysieren kann, kann bei Anreicherung von Wasserstoffperoxid bis zu einer bestimmten Konzentration das Wachstum und die Vermehrung von Escherichia coli, Salmonella, Pasteurella, Staphylococcus und Vibrio direkt gehemmt werden.

Enzympräparate, z. B. Glucoseoxidase in Kombination mit Lactoperoxidase (LPO), Amyloglucosidase, Glucanase, Lysozym etc., können Zahnbelag, Zahnstein und die Entstehung von Karies entfernen oder vermindern. Die Stabilität von Arzneimitteln, die Glucoseoxidase enthalten, ist im Vergleich zu anderen um das Dreifache erhöht. Zubereitungen mit Glucoseoxidase, Lactoperoxidase und Iodverbindungen können zur Mundhygiene eingesetzt werden, um Mundgeruch zu stoppen. Ein Doppel-Enzym-Kaugummi mit Glucoseoxidase und Lactoperoxidase erreicht beim Kauen eine antibakterielle Wirksamkeit von 96 % bis 99 %. Glucoseoxidase kann zur zielgerichteten Behandlung von wasserstoffperoxidempfindlichen Lymphomen eingesetzt werden. Enzymelektroden können für die quantitative in vitro-Glucosebestimmung in Serum (Pulpa), Urin und Liquor cerebrospinalis verwendet werden.