Neutrale Protease

Neutrale Proteasen beziehen sich auf eine Klasse von Proteasen, die in einer neutralen, schwach sauren oder schwach alkalischen Umgebung katalytisch wirken können. Ihr optimales pH liegt zwischen 6,0 und 7,5 und sie können die Hydrolyse von Peptidbindungen von Proteinen katalysieren, wobei Aminosäuren oder Peptide freigesetzt werden. Neutrale Proteasen haben Vorteile wie eine schnelle Reaktionsrate, keine industrielle Verschmutzung und eine breite Anpassungsfähigkeit an Reaktionsbedingungen.

Klassifikation

Neutrale Proteasen können je nach katalytischem Mechanismus und funktioneller Gruppe der aktiven Stelle in vier Hauptkategorien unterteilt werden: Serinproteasen, Aspartatproteasen, Cysteinproteasen und Metalloproteasen.

Serinprotease: Serinproteasen katalysieren typischerweise die Hydrolyse von Substratproteinen in zwei Schritten. Während des Hydrolyseprozesses wird ein intermediärer Dimer des kovalenten Enzym-Peptid-Komplexes gebildet, gefolgt vom Verlust von Aminosäuren und dem Brechen von Peptidketten. Die Acylgruppe wird dann entfernt, und die Peptidbindung wird durch den nucleophilen Angriff des Intermediats durch Wasser hydrolysiert. Die meisten Serinproteasen bilden eine typische Triplettstruktur von Ser-His-Asp, und eine kleine Menge Serin dient als katalytische Basis.

Aspartatprotease: Die Aktivitätsstelle der Aspartatprotease hängt von der Aspartat-Rest ab. Die Aspartat-Reste in der Aktivitätsstelle der meisten Pepsin-Familien befinden sich im Asp-Thr-Gly-Xaa-Motiv, das an den bilobaten Amino- und Carboxylenden lokalisiert ist. Xaa kann durch Ser oder Thr ersetzt werden, die Seitenkette ist durch Wasserstoffbrückenbindung mit Asp verbunden.

Cysteinprotease: Die katalytischen Mechanismen der Cysteinprotease sind ähnlich wie die der Serinprotease. Die Untersuchung des katalytischen Mechanismus mehrerer Cysteinproteasen aus verschiedenen evolutionären Quellen zeigt äußerst offensichtliche Ähnlichkeiten. Papain wird als Prototyp für den katalytischen Mechanismus der Cysteinproteasen angesehen. Der Unterschied im katalytischen Mechanismus liegt hauptsächlich in den unterschiedlichen Konformationen der aktiven Stellen: Serinproteasen enthalten ein Ser-His-Asp-katalytisches Triade, während während der Hydrolyse von Cysteinproteasen eine Säuregruppe und ein acylmercaptan-intermediär gebildet werden.

Metalloproteinase: Metalloproteinase hat einen anderen katalytischen Mechanismus im Vergleich zu den oben genannten Proteasen. Diese Klasse von Enzymen hängt von der Anwesenheit von zweiwertigen Metallkationen ab und kann durch Dialyse oder Metallchelate inaktiviert werden. Röntgenkristallographiestudien haben gezeigt, dass die meisten Metalloproteasen während der Kristallbildung eine Stelle für die Metallbindung in der Enzymstruktur bilden. Das Metallkation ist normalerweise Zn²⁺, kann aber auch andere Metallkationen wie Mg²⁺ und Cu²⁺ sein. Das Metallion an der aktiven Stelle des Enzyms kann durch einen Chelatbildner wie EDTA oder OP chelatiert werden, sodass das Enzym seine partielle oder vollständige Aktivität verliert. Dieser Prozess ist normalerweise reversibel und die Enzymaktivität kann durch erneutes Hinzufügen von Metallionen wiederhergestellt werden.

Quellen

Aufgrund der besonderen Rolle im Stoffwechsel sind neutrale Proteasen weit verbreitet in Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen. Im Vergleich zu anderen Quellen hat mikrobielles Protease unvergleichliche Vorteile aufgrund seiner Kulturbedingungen, der Kontrolle der Produktionskosten und des Vorbereitungsskalas. Neutrale Proteasen können je nach ihren Quellen in bakterielle neutrale Proteasen, pilzliche neutrale Proteasen und virale neutrale Proteasen unterteilt werden.

Bakterielle neutrale Protease: Die am häufigsten verwendeten neutralen Proteasen auf dem Markt sind die bakteriellen neutralen Proteasen, insbesondere die von Bacillus, wie Bacillus subtilis und Bacillus licheniformis. Die Enzymaktivität der bakteriellen neutralen Protease hängt größtenteils von zweiwertigen Kationen ab, wie Mg²⁺, Zn²⁺ und Ca²⁺. Bakterielle Proteasen haben eine starke Hydrolysefähigkeit, eine schnelle Reaktionsrate, das hydrolysierte Produkt hat weniger Bitterkeit, sodass sie in der Lebensmittelindustrie weit verbreitet eingesetzt werden.

Pilzliche neutrale Protease: Viele Pilze können neutrale Proteasen produzieren, wie Aspergillus oryzae, Rhizopus und Mucor. Darüber hinaus ist der katalytische pH der pilzlichen Protease breit (normalerweise 4 bis 11). Aspergillus oryzae kann saure Proteasen, neutrale Proteasen und alkalische Proteasen produzieren. Die Produktion von pilzlichen Proteasen erfolgt hauptsächlich durch Feststofffermentation. Ihre Aktivität der Protease hängt hauptsächlich von zweiwertigen Kationen ab, die durch Metallchelate beeinflusst werden können. Im Allgemeinen sind die Reaktionsrate und Stabilität der pilzlichen Proteasen relativ niedriger als die der bakteriellen Proteasen.

Virale neutrale Protease: Die Forschung zu viralen Proteasen hat sich weitgehend auf das medizinische Feld konzentriert. Aspartatproteasen, Serinproteasen und Cysteinproteasen sind in viralen Proteasen enthalten. Alle virusabgeleiteten Proteasen sind Endonukleasen, und ihre Aktivität erfordert nicht die Teilnahme von Metallionen. Aufgrund ihrer besonderen Rolle in der Medizin wurden immer mehr Forschungen zur dreidimensionalen Struktur, Translation, Expressionsmechanismus und Funktionsmechanismus von viralen Proteasen durchgeführt.

Anwendungen

Anwendungen in der Lebensmittelindustrie: Neutrale Proteasen werden in der Lebensmittelindustrie weit verbreitet eingesetzt, um die Lebensmittelqualität, Stabilität und Löslichkeit zu verbessern. Neutrale Proteasen, die von Aspergillus oryzae produziert werden, können die Eigenschaften von Gluten im Mehl durch Hydrolyse verändern, und bakterielle neutrale Proteasen können verwendet werden, um die Dehnung und Zähigkeit des Teigs zu erhöhen. Neutrale Proteasen können auch zur Klärung von Getränken angewendet werden. Da der Auszug von schwarzem Tee mit neutraler Protease verdaut wird, ändert sich der Ultrafiltrationsfluss erheblich aufgrund seines hohen löslichen Proteingehalts. Neutrale Proteasen können auch zur Zartmachung von Fleisch verwendet werden, hauptsächlich weil neutrale Proteasen Myofibrillen und Elastin auflösen können. Neutrale Proteasen spielen auch eine wichtige Rolle bei der Verarbeitung von Sojaprodukten. Im Fall von Bohnenpaste beispielsweise sorgt die neutrale Protease, die von dem Pilz während der Fermentation produziert wird, dafür, dass das Protein im Sojamaterial vollständig hydrolysiert wird. Während sie notwendige Wachstumsfaktoren für Mikroorganismen bereitstellt, fördert sie auch die Produktion vieler nützlicher Aminosäuren und erhöht effektiv die Nährstoffe der Produkte.

Anwendungen in der Lederindustrie: Proteasen werden hauptsächlich verwendet, um selektiv nicht-Pektin-Komponenten im Leder zu hydrolysieren und nicht-Fibrin zu entfernen, wie Albumin und Globulin. Der Einsatz von Proteasen in der Lederindustrie kann die Einweichzeit verkürzen. Die Wahl der neutralen Proteasepräparation hängt von der Spezifität des Matrixproteins ab, und die Menge des Enzyms hängt von der Weichheit und Härte des behandelten Leders ab. Die Anwendung von neutralen Proteasen in der Verarbeitung von Lederprodukten hilft nicht nur, die Umweltverschmutzung zu reduzieren, sondern spart auch Energie.

Anwendungen in der Kosmetik: Neutrale Proteasen werden in der Produktion und Entwicklung von Kosmetika weit verbreitet eingesetzt. Neutrale Proteasen, die in Kosmetika verwendet werden, stammen meist aus Mikroorganismen und Pflanzen. Die Zugabe von neutraler Protease zu Zahnpasta hilft, Zahnstein zu entfernen, insbesondere Bacillus subtilis neutrale Protease. Neutrale Proteasen werden der Creme hinzugefügt, um Schuppen aufzulösen, die Haut weich zu machen, den Hautstoffwechsel zu fördern, die Hautaufnahme von Medikamenten zu erhöhen und den Widerstand von pathogenen Bakterien in der Hornschicht zu verringern. Gleichzeitig ist die mikrobielle Quelle der neutralen Protease hitzebeständiger und kann die alternden Keratinozyten entfernen, die Entfernungseffekte verstärken und die Bildung von Akne verhindern.

Anwendungen in der pharmazeutischen Industrie: In der pharmazeutischen Industrie werden Proteasen zur Herstellung von Arzneimitteln eingesetzt, wie z.B. Wunddebridement-Salbe, Salbe zur Weichmachung von Brandnarben, entzündungshemmende Schwellungs- und Schleimstoffe. Neutrale Proteasen haben eine große Vielfalt und Substratspezifität, was ihnen einen offensichtlichen Vorteil bei der Entwicklung hochwirksamer Therapeutika verschafft.