Mit fortschrittlichen Technologien und umfassender Enzymexpertise bietet Creative Enzymes zuverlässige Enzymaktivitätsassays für konventionelle ebenso wie für spezifische, anspruchsvolle Forschungsanforderungen. Unsere Prüfdienstleistungen sind für ihre hohe Qualität und kurze Bearbeitungszeiten bekannt und werden von einer Vielzahl an Expertinnen/Experten und Wissenschaftlerinnen/Wissenschaftlern empfohlen. Zur Unterstützung unterschiedlichster enzymatischer Forschung stellt Creative Enzymes verschiedene Ansätze zur Messung der Enzymaktivität bereit, um unterschiedliche Studienanforderungen abzudecken. Neben etablierten Verfahren wie spektrophotometrischen und kolorimetrischen Assays hat Creative Enzymes modernste Technologien und hochentwickelte Instrumentierung eingeführt, um weiterentwickelte Messmethoden zu realisieren. Als eine der präzisesten Testmethoden wird die kalorimetrische Analyse in mehreren biologischen Anwendungsfeldern eingesetzt. Wir bieten daher mit Stolz einen Enzymaktivitätsassay-Service auf Basis der isothermen Titrationskalorimetrie an.

Die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) wird heute deutlich breiter eingesetzt als zu ihrer Einführung in die Branche vor rund zwei Jahrzehnten. ITC ist mittlerweile ein etabliertes Verfahren zur Bestimmung von Bindungsaffinitäten an Enzyme. Das Grundprinzip besteht in der direkten Messung der Enthalpieänderung einer bimolekularen Bindungsinteraktion bei konstanter Temperatur. Die Methode erfasst die über die Zeit freigesetzte oder absorbierte Wärme und stellt damit eine universelle und praktikable Methodik dar, um die Menge reagierender Moleküle – einschließlich der Bindungsthermodynamik – zu quantifizieren sowie die Reaktionsgeschwindigkeit zu bestimmen.

Der universelle Charakter der Technik zeigt sich in der großen Bandbreite an Systemen, die bislang mittels ITC untersucht wurden. Aktuelle Übersichtsarbeiten beschreiben den Nutzen der Methode für die Untersuchung von Protein–Arzneistoff-, Arzneistoff–DNA-, Protein–DNA- und Protein–Kohlenhydrat-Interaktionen. Darüber hinaus ist ITC in keiner Weise durch das Molekulargewicht des Liganden eingeschränkt. Im Vergleich zu anderen Methoden der Aktivitätsanalyse bietet ITC wesentliche Vorteile. Üblicherweise bestimmen häufig verwendete spektrophotometrische und Fluoreszenz-Assays die Enzymaktivität über die Messung der Lichtabsorption bzw. Fluoreszenz von Substrat oder Produkt. Viele Substrate und Produkte sind jedoch nicht spektroskopisch aktiv. Bei gekoppelten Assays, die über die Kopplung einer weiteren Reaktion arbeiten und das Produkt der ersten Reaktion als Substrat der zweiten nutzen, kann die Bestimmungsgenauigkeit durch zusätzliche Variablen beeinträchtigt werden. Bei Untersuchungen zur Enzyminhibition durch kleine Liganden können klassische Methoden zudem an Zuverlässigkeit verlieren, wenn der kleine Ligand selbst absorbiert oder fluoresziert. Stopped-Flow-Techniken sind zwar präzise, für Routineanalysen jedoch zeitaufwendig und kostenintensiv. Da nahezu alle chemischen Reaktionen Wärme freisetzen oder aufnehmen, nutzt ITC diese intrinsische Eigenschaft und erfordert keine Modifikation oder Markierung (Labeling) des zu analysierenden Systems. Zudem ist die Methode unkompliziert und schnell, benötigt nur geringe Materialmengen und kann in Lösung durchgeführt werden. ITC ist damit ein zuverlässiges und schnelles Verfahren zur Charakterisierung enzymatischer Reaktionen – ohne die Notwendigkeit einer Systemmodifikation oder Markierung.

Dennoch gilt: Jede Prüfmethode hat Limitationen. Ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis wird nur erreicht, wenn die Reaktion mit einer Geschwindigkeit abläuft, die ausreichend Wärme in der ITC-Zelle erzeugt, um die instrumentelle Nachweisgrenze zu überschreiten. Dies ist in der Regel bei Systemen mit einem k_cat von über 1 min^-1 gegeben. Aufgrund der intrinsischen Unterschiede zwischen enzymatischen Systemen und der je nach Reaktion variierenden Wärmeentwicklung lassen sich optimale Messbedingungen nicht im Voraus pauschal quantifizieren. Während der Durchführung ist daher sorgfältig sicherzustellen, dass die experimentellen Bedingungen passend zum jeweiligen Analysesystem gewählt werden. Die umfangreiche Erfahrung von Creative Enzymes trägt dazu bei, einen geeigneten Analyseprozess für ITC-Assays zu etablieren. Darüber hinaus setzt Creative Enzymes angesichts der hohen Geräteabhängigkeit ausschließlich erstklassige Instrumente ein, um präzise Ergebnisse zu gewährleisten.

Abbildung: Schematische Darstellung eines isothermen Titrationskalorimeters zur Untersuchung enzymatischer Reaktionen.
Referenz: Luca Mazzei et al. J. Vis. Exp. 2014, (86), e51487.

Als treibende Kraft für Verbesserungen in Enzymaktivitätsassays verfolgt Creative Enzymes konsequent das Ziel, für jede Kundin und jeden Kunden noch zuverlässigere Tests bereitzustellen. Die Ergebnisse werden mit exzellenter Qualität und hoher Reproduzierbarkeit gewährleistet. Unsere ITC-Enzymassay-Services werden Ihre Forschung erheblich beschleunigen. Bei technischen Fragen kontaktieren Sie uns bitte für professionelle Unterstützung.

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