Die Sequenzanalyse des vollständigen cDNA-Klons zeigte, dass gek ein großes Protein mit 1613 Aminosäuren kodiert (Abbildung 1a). Der N-Terminus von Gek enthält eine vorhergesagte Ser/Thr-Kinase-katalytische Domäne (Abbildung 1b). Darauf folgt eine große Coiled-Coil-Domäne mit Sequenzhomologie zur Myosin-Schwerketten (Abbildung 1a), eine Cys-reiche Domäne, die der Phorbolester-/Diglycerid-Bindungsstruktur der Protein-Kinase C-Domäne ähnelt (Abbildung 1c), und eine Pleckstrin-Homologie-Domäne (Abbildung 1d), die in vielen Signalmolekülen für Protein-Lipid-Interaktionen und Rekrutierung zur Zelloberfläche vorhanden ist. Nahe dem C-Terminus von Gek befindet sich eine Sequenz, die der Cdc42/Rac-interaktiven Bindungsdomäne (CRIB) ähnelt (Abbildung 1e). Tatsächlich entspricht die Deletion von drei Resten in Gek (GekΔISP) (Abbildung 1e) den drei konservierten Resten in der CRIB-Domäne, was deren Bindung an Dcdc42 stört. Gek zeigt eine starke Sequenzähnlichkeit zu menschlicher tonischer Dystrophin-Protein-Kinase (DMPK). Gek und DMPK teilen sich 63% Identität in der Aminosäuresequenz innerhalb des 271-aa-katalytischen Kerns (Abbildung 1b), und die Sequenzähnlichkeit zwischen den beiden Proteinen übersteigt die katalytische Domäne in beide Richtungen (Abbildung 1a und b). DMPK ist jedoch viel kleiner als Gek. Interessanterweise könnte eine kürzlich identifizierte Klasse von Rho-bindenden Kinasen als kleine GTPase Rho-Effektoren fungieren, mit Domänen, die Gek ähnlich sind (Abbildung 1a). Darüber hinaus ist die Kinasedomäne der Rho-bindenden Kinase DMPK ähnlich, obwohl DMPK ähnlicher zu der Säugetier-Rho-Kinase ist als Drosophila Gek (Identitäten im katalytischen Kern sind 63% und 49%, respektive). Ähnlich ist die Phorbolester-bindende Domäne der Protein-Kinase C Geks Cys-reicher Domäne (Abbildung 1c) ähnlicher als der Rho-bindenden Kinase.

Abbildung 1. Primärstruktur von Gek. ( L, Luo; et al.1997)

Gek ist eine Protein-Kinase.

Um zu testen, ob Gek Kinaseaktivität zeigte, transfizierten Wissenschaftler Drosophila Schneider-Zellen (S2) mit einem Wildtyp-Gek-Expressionskonstrukt, das mit myc-Epitopen unter der Kontrolle des ubiquitären Aktin-Promotors gekennzeichnet war. Die Wissenschaftler immunopräzipitierten dann das Gek-Protein mit einem Anti-myc-Antikörper. Durch die Verwendung von Histonen als Substraten erkannten die Wissenschaftler Kinaseaktivität in einem Komplex von immunopräzipitierten Zellen, die mit myc-Gek transfiziert wurden, konnten jedoch nicht aus mock-transfizierten Zellen immunopräzipitieren. Um die Möglichkeit auszuschließen, dass die Kinaseaktivität während der Immunpräzipitation durch eine andere, eng verwandte Kinase zu Gek verursacht wurde, transfizierten die Wissenschaftler S2-Zellen mit einem myc-getaggten mutierten Gek-Konstrukt (A105K), dessen Mutationen mit Lysin-Resten in Kinasen Domänen vorhersagen, die für die Kinaseaktivität essentiell sind. Immunopräzipitiertes myc-GekA105K zeigte keine Kinaseaktivität über dem Hintergrund, obwohl das Expressionsniveau des GekA105K-Proteins mit dem von Wildtyp-Gek vergleichbar war, was durch Western Blotting mit Anti-myc-Antikörpern nachgewiesen wurde. Da Einzelpunktmutationen in der Kinasedomäne wahrscheinlich nicht die Bindung von Gek an andere verwandte Proteine stören, schlossen die Wissenschaftler, dass Gek-Proteine Kinaseaktivität besitzen.

Referenz

1. L, Luo; et al. Genghis Khan (Gek) as a putative effector for Drosophila Cdc42 and regulator of actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1997.