Die Sequenzanalyse des vollständigen cDNA-Vollängenklons zeigte, dass gek für ein großes Protein mit 1613 Aminosäuren kodiert (Abbildung 1a). Der N‑Terminus von Gek enthält eine vorhergesagte katalytische Ser/Thr‑Kinase‑Domäne (Abbildung 1b). Daran schließt sich eine große Coiled‑coil‑Domäne mit Sequenzhomologie zur Myosin‑Schwerkette an (Abbildung 1a), eine Cys‑reiche Domäne, die der Phorbolester-/Diglycerid‑Bindungsstruktur der Protein‑Kinase‑C‑Domäne ähnelt (Abbildung 1c), sowie eine Pleckstrin‑Homologie‑Domäne (Abbildung 1d), die in vielen Signalmolekülen für Protein‑Lipid‑Interaktionen und die Rekrutierung an die Zelloberfläche vorkommt. Nahe dem C‑Terminus von Gek befindet sich eine Sequenz, die der Cdc42/Rac‑interaktiven Bindungsdomäne (CRIB) ähnelt (Abbildung 1e). Tatsächlich entspricht die Deletion von drei Resten in Gek (GekΔISP) (Abbildung 1e) den drei konservierten Resten in der CRIB‑Domäne und stört deren Bindung an Dcdc42. Gek zeigt eine ausgeprägte Sequenzähnlichkeit zur humanen tonic dystrophin protein kinase (DMPK). Gek und DMPK teilen 63 % Aminosäuresequenzidentität innerhalb des 271 AS umfassenden katalytischen Kerns (Abbildung 1b), und die Sequenzähnlichkeit zwischen beiden Proteinen erstreckt sich in beide Richtungen über die katalytische Domäne hinaus (Abbildung 1a und b). DMPK ist jedoch deutlich kleiner als Gek. Interessanterweise könnte eine kürzlich identifizierte Klasse Rho‑bindender Kinasen als Rho‑Effektoren kleiner GTPasen fungieren und Domänen aufweisen, die denen von Gek ähneln (Abbildung 1a). Darüber hinaus ist die Kinase‑Domäne der Rho‑bindenden Kinase DMPK ähnlich, obwohl DMPK der Säuger‑Rho‑Kinase ähnlicher ist als Drosophila‑Gek (Identitäten im katalytischen Kern: 63 % bzw. 49 %). Ebenso ist die Phorbolester‑Bindungsdomäne der Protein‑Kinase C der Cys‑reichen Domäne von Gek (Abbildung 1c) ähnlicher als der Rho‑bindenden Kinase.

Abbildung 1. Primärstruktur von Gek. (L, Luo; et al. 1997)

Gek ist eine Proteinkinase.

Um zu prüfen, ob Gek Kinaseaktivität aufweist, transfizierten Wissenschaftler Drosophila‑Schneider‑Zellen (S2) mit einem Wildtyp‑Gek‑Expressionskonstrukt, das mit myc‑Epitopen markiert war und unter der Kontrolle des ubiquitär aktiven Actin‑Promotors stand. Anschließend immunpräzipitierten die Wissenschaftler das Gek‑Protein unter Verwendung eines Anti‑myc‑Antikörpers. Unter Verwendung von Histonen als Substraten detektierten die Wissenschaftler Kinaseaktivität in einem Komplex aus immunpräzipitierten Zellen, die mit myc‑Gek transfiziert worden waren, jedoch nicht in Immunpräzipitaten aus mock‑transfizierten Zellen. Um die Möglichkeit auszuschließen, dass die Kinaseaktivität während der Immunpräzipitation durch eine andere, eng mit Gek verwandte Kinase verursacht wurde, transfizierten die Wissenschaftler S2‑Zellen mit einem myc‑markierten mutierten Gek‑Konstrukt (A105K), wobei Mutationen von Lysinresten in Kinasen Domänen betreffen, die für die Kinaseaktivität essenziell sind. Immunpräzipitiertes myc‑GekA105K zeigte keine Kinaseaktivität über dem Hintergrund, obwohl das Expressionsniveau des GekA105K‑Proteins mit dem des Wildtyp‑Gek vergleichbar war, was mittels Western Blot unter Verwendung von Anti‑myc‑Antikörpern nachgewiesen wurde. Da einzelne Punktmutationen in der Kinase‑Domäne die Bindung von Gek an andere verwandte Proteine voraussichtlich nicht beeinträchtigen, schlossen die Wissenschaftler, dass Gek‑Proteine Kinaseaktivität besitzen.

Referenz

1. L, Luo; et al. Genghis Khan (Gek) as a putative effector for Drosophila Cdc42 and regulator of actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1997.