Die Sequenzanalyse des vollständigen cDNA-Klons zeigte, dass gek für ein großes Protein mit 1613 Aminosäuren kodiert (Abbildung 1a). Das N-terminale Ende von Gek enthält eine vorhergesagte Ser/Thr-Kinase-Katalysedomäne (Abbildung 1b). Darauf folgt eine große Coiled-Coil-Domäne mit Sequenzhomologie zur Myosin-Schwerkette (Abbildung 1a), eine Cys-reiche Domäne, die der Phorbolester-/Diglycerid-Bindungsstruktur der Protein Kinase C-Domäne ähnelt (Abbildung 1c), und eine Pleckstrin-Homologiedomäne (Abbildung 1d), die in vielen Signalmolekülen für Protein-Lipid-Interaktionen und die Rekrutierung an die Zelloberfläche vorhanden ist. Nahe dem C-Terminus von Gek befindet sich eine Sequenz, die der Cdc42/Rac-interaktiven Bindungsdomäne (CRIB) ähnelt (Abbildung 1e). Tatsächlich entspricht die Deletion von drei Resten in Gek (GekΔISP) (Abbildung 1e) den drei konservierten Resten in der CRIB-Domäne und stört deren Bindung an Dcdc42. Gek zeigt eine starke Sequenzähnlichkeit zur menschlichen tonischen Dystrophin-Proteinkinase (DMPK). Gek und DMPK teilen 63 % Aminosäuresequenz-Identität innerhalb des 271-aa-Katalysekerns (Abbildung 1b), und die Sequenzähnlichkeit zwischen den beiden Proteinen reicht in beide Richtungen über die Katalysedomäne hinaus (Abbildung 1a und b). DMPK ist jedoch deutlich kleiner als Gek. Interessanterweise könnte eine kürzlich identifizierte Klasse von Rho-bindenden Kinasen als Effektoren der kleinen GTPase Rho fungieren, mit Domänen, die Gek ähneln (Abbildung 1a). Darüber hinaus ist die Kinasedomäne der Rho-bindenden Kinase der von DMPK ähnlich, obwohl DMPK der Säugetier-Rho-Kinase ähnlicher ist als Drosophila Gek (Identitäten im Katalysekern betragen 63 % bzw. 49 %). Ebenso ist die Phorbolester-Bindungsdomäne der Protein Kinase C der Cys-reichen Domäne von Gek (Abbildung 1c) ähnlicher als der Rho-bindenden Kinase.

Abbildung 1. Primärstruktur von Gek. ( L, Luo; et al.1997)

Gek ist eine Proteinkinase.

Um zu testen, ob Gek Kinaseaktivität zeigte, transfizierten Wissenschaftler Drosophila Schneider-Zellen (S2) mit einem Wildtyp-Gek-Expressionskonstrukt, das mit myc-Epitopen unter der Kontrolle des ubiquitären Actin-Promotors markiert war. Anschließend immunpräzipitierten die Wissenschaftler das Gek-Protein mit einem Anti-myc-Antikörper. Unter Verwendung von Histonen als Substrate wurde Kinaseaktivität in einem Komplex von immunpräzipitierten Zellen, die mit myc-Gek transfiziert wurden, nachgewiesen, jedoch nicht in immunpräzipitierten Zellen von Mock-transfizierten Zellen. Um auszuschließen, dass die Kinaseaktivität durch eine andere, eng mit Gek verwandte Kinase während der Immunpräzipitation verursacht wurde, transfizierten Wissenschaftler S2-Zellen mit einem myc-markierten mutierten Gek-Konstrukt (A105K), bei dem Mutationen mit Lysinresten in Kinasen Domänen vorhersagen, die für die Kinaseaktivität essentiell sind. Immunpräzipitiertes myc-GekA105K zeigte keine Kinaseaktivität über dem Hintergrund, obwohl das Expressionsniveau des GekA105K-Proteins mit dem des Wildtyp-Gek vergleichbar war, was durch Western Blotting mit Anti-myc-Antikörpern gezeigt wurde. Da Einzelpunktmutationen in der Kinasedomäne die Bindung von Gek an andere verwandte Proteine wahrscheinlich nicht stören, schlossen die Wissenschaftler, dass Gek-Proteine Kinaseaktivität besitzen.

Referenz

1. L, Luo; et al. Dschingis Khan (Gek) als mutmaßlicher Effektor für Drosophila Cdc42 und Regulator der Aktinpolymerisation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1997.