Entdeckung der PRP4-Kinase

Vor fünfundzwanzig Jahren schlugen wir und andere vor, dass die in Spalthefe F. saccharomyces gefundenen Introntypen einen anderen Typ von Introns darstellen als die in Saccharomyces cerevisiae gefundenen. Diese Empfehlung basiert hauptsächlich auf der Beobachtung, dass Simian Virus 40 (SV40) small T Antigen-Transkripte mit 66 nt Introns korrekt dargestellt werden und small T Antigen-Proteine in Schizosaccharomyces pombe synthetisiert werden, jedoch keine Synthese in Saccharomyces cerevisiae stattfindet. Wir verwendeten Spalthefe und erzeugten temperatursensitive (ts) Mutanten, um diejenigen Mutanten zu identifizieren, die bei Grenztemperaturen Defekte im prä-mRNA-Spleißen anzeigen. Für diese Screens konstruierten wir ein künstliches Reportergen unter Verwendung des natürlichen intronfreien ura4-Gens, das die an der Uracilsynthese beteiligte Carboxylase kodiert. Das Einfügen eines Introns in das ura4-Gen führte zur Entdeckung, dass Introns in Schizosaccharomyces pombe unabhängig von ihrem Exon-Hintergrund identifiziert werden können. Es wurde dann gezeigt, dass Introns in Schizosaccharomyces pombe durch einen Mechanismus identifiziert werden, der heute als „Intron-Definition“ bezeichnet wird. Die ts-Mutante wurde mit einem Plasmid transformiert, das eine 108 bp Intron-Sequenz im ura4-Gen enthielt. Anschließend wurde das Vorhandensein von mRNA und prä-mRNA des ura4-108I-Transkripts unter Wachstumsbedingungen (zulässige Temperatur von 25 °C) und Nichtwachstumsbedingungen (eingeschränkte Temperatur von 36 °C) verglichen. Von Hunderten von ts-Mutanten zeigten drei gespleißte (mRNA) und ungespleißte (prä-mRNA) Transkripte des ura4-I108-Reportergens bei zulässigen Temperaturen, aber die mRNA nahm zeitabhängig ab, wenn sie auf eine Grenztemperatur übertragen wurde, während die prä-mRNA stabil blieb. Dies zeigt, dass das ura4-108I-Gen weiterhin transkribiert wurde, aber künstliche Introns unter dieser Bedingung nicht entfernt wurden. Darüber hinaus wurden die natürlichen Introns der cdc2-Transkripte in diesen Mutanten bei der Grenztemperatur nicht entfernt.

Mammalisches Prp4K ist an anderen zellulären Prozessen beteiligt

Es wurde gezeigt, dass das mammalische Prp4K mit vielen verschiedenen zellulären Strukturen und definierten Proteinen (z. B. Spots, Spleißosomenpartikeln, Chromatin-Komplexen) und Proteinen am Kinetochor interagiert und Proteine an Kontrollpunkten der Spindelmontage im Gewebe co-lokalisiert.

Prp4-Kinase und ihr Substrat

Zwei Proteinkinasen, die Spalthefe Prp4-Kinase und die chimäre Maus-Prp4-Kinase, bestehen aus einer Maus-Kinasedomäne, die dem N-terminalen Prp4 von Schizosaccharomyces pombe vorangestellt ist, und reichern sie in vitro für Arginin/Serin-RS-Domänenphosphorylierung an. Das Säugetierprotein ASF/SF2. Dieses Protein gehört zur SR-Superfamilie der Spleißfaktoren. Das SR-Protein besteht aus einem oder zwei N-terminalen RNA-Bindedomänen (RBDs) und einer C-terminalen Arginin/Serin-reichen (RS) Domäne. Mitglieder der SR-Protein-Superfamilie bei Säugetieren sind an konstitutivem Spleißen beteiligt und spezifische Regulatoren des alternativen Spleißens. Sie binden an ihre Partner und verbinden das Spleißen mit Transkription und RNA-Export. Die allgemeine Funktion der SR-Proteine wird durch reversible Phosphorylierung reguliert. In Spalthefe wurden zwei SR-Proteine identifiziert. Srp1 enthält eine RBD am N-Terminus, gefolgt von drei Serin-Elementen, die wir RS1, RS2 und RS3 nennen, die jeweils verschiedene Anzahlen von SR- und SP-Dipeptiden enthalten. Phosphorylierte proteomische Analysen der Spalthefe zeigten mehrere phosphorylierte Serine in diesen drei RS-Elementen. Srp2 enthält zwei N-terminale RBD und zwei SR- und SP-Dipeptid-Elemente am C-Terminus, die wir SR1 und SR2 nennen. Auch hier wurde durch Phosphoproteinanalyse phosphoryliertes Serin in diesen Elementen nachgewiesen. Umfangreiche Mutationsanalysen wurden an zwei Elementen (SR1 und SR2) durchgeführt, indem Serin durch andere Aminosäuren ersetzt und die Auswirkungen der Mutationen in vivo getestet wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass, wenn beide Serine in beiden Elementen mutiert waren, das GFP-Srp2-Fusionsprotein nicht in den Zellkern gelangen konnte, sondern an verschiedenen Punkten in der Zelle verteilt gefunden wurde.

Referenz:

1. Luetzelberger M; et al. Die Prp4-Kinase: Ihre Substrate, Funktion und Regulation beim prä-mRNA-Spleißen. Proteinphosphorylierung in der menschlichen Gesundheit. 2012.