Entdeckung der PRP4-Kinase

Vor fünfundzwanzig Jahren schlugen wir und andere vor, dass die in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe vorkommenden Introntypen einen anderen Introntyp darstellen als die in Saccharomyces cerevisiae gefundenen Introns. Diese Empfehlung stützte sich im Wesentlichen auf die Beobachtung, dass Transkripte des Simian-Virus 40 (SV40) des Small‑T‑Antigens mit 66 nt langen Introns in Schizosaccharomyces pombe korrekt prozessiert werden und Small‑T‑Antigen‑Proteine synthetisiert werden, wohingegen in Saccharomyces cerevisiae keine Synthese erfolgt. Wir verwendeten Spalthefe und erzeugten temperatursensitive (ts) Mutanten, um bei restriktiven Temperaturen gezielt Mutanten mit Defekten im Pre‑mRNA‑Spleißen zu identifizieren. Für diese Screens konstruierten wir ein künstliches Reportergen auf Basis des natürlichen intronfreien ura4‑Gens, das für die an der Uracilsynthese beteiligte Carboxylase kodiert. Die Insertion eines Introns in das ura4‑Gen führte zu der Erkenntnis, dass Introns in Schizosaccharomyces pombe unabhängig vom Exon‑Kontext erkannt werden können. Anschließend wurde gezeigt, dass Introns in Schizosaccharomyces pombe über einen Mechanismus erkannt werden, der heute als „Intron‑Definition“ bezeichnet wird. Die ts‑Mutante wurde mit einem Plasmid transformiert, das eine 108 bp lange Intronsequenz im ura4‑Gen enthielt. Danach wurde das Vorhandensein von mRNA und Pre‑mRNA des ura4‑108I‑Transkripts unter Wachstumsbedingungen (permissive Temperatur von 25 °C) und Nicht‑Wachstumsbedingungen (restriktive Temperatur von 36 °C) verglichen. Von den Hunderten ts‑Mutanten zeigten drei bei permissiver Temperatur sowohl gespleißte (mRNA) als auch ungespleißte (Pre‑mRNA) Transkripte des ura4‑I108‑Reportergens; nach Transfer auf die restriktive Temperatur wurde jedoch ein zeitabhängiger Rückgang der mRNA beobachtet, während die Pre‑mRNA stabil blieb. Dies weist darauf hin, dass das ura4‑108I‑Gen weiterhin transkribiert wurde, die künstlichen Introns unter diesen Bedingungen jedoch nicht entfernt wurden. Darüber hinaus wurden bei diesen Mutanten die natürlichen Introns der cdc2‑Transkripte bei restriktiver Temperatur ebenfalls nicht entfernt.

Säugetier‑Prp4K ist an weiteren zellulären Prozessen beteiligt

Es wurde gezeigt, dass Säugetier‑Prp4K mit zahlreichen unterschiedlichen zellulären Strukturen und definierten Proteinen interagiert (z. B. nuclear speckles, Spleißosomen‑Partikel, Chromatin‑Komplexe) sowie mit Proteinen am Kinetochor und dass es mit Proteinen an Kontrollpunkten der Spindelassemblierung kolokalisiert.

Prp4‑Kinase und ihr Substrat

Zwei Proteinkinasen, die Prp4‑Kinase der Spalthefe und eine chimäre Maus‑Prp4‑Kinase, die aus einer Maus‑Kinase‑Domäne besteht, der das N‑terminale Prp4 von Schizosaccharomyces pombe vorangestellt ist, phosphorylieren in vitro bevorzugt Arginin/Serin‑reiche RS‑Domänen. Als Substrat wurde das Säugetierprotein ASF/SF2 angereichert. Dieses Protein gehört zur SR‑Superfamilie der Spleißfaktoren. SR‑Proteine bestehen aus einer oder zwei N‑terminalen RNA‑Bindedomänen (RBDs) und einer C‑terminalen Arginin/Serin‑reichen (RS‑)Domäne. Mitglieder der SR‑Protein‑Superfamilie in Säugetieren sind an konstitutivem Spleißen beteiligt und fungieren als spezifische Regulatoren des alternativen Spleißens. Sie binden an ihre Partner und koppeln Spleißen mit Transkription und RNA‑Export. Die allgemeine Funktion von SR‑Proteinen wird durch reversible Phosphorylierung reguliert. In der Spalthefe wurden zwei SR‑Proteine identifiziert. Srp1 enthält am N‑Terminus eine RBD, gefolgt von drei Serin‑Elementen, die wir als RS1, RS2 bzw. RS3 bezeichnen und die unterschiedliche Anzahlen von SR‑ und SP‑Dipeptiden enthalten. Eine phosphoproteomische Analyse der Spalthefe zeigte mehrere phosphorylierte Serine in diesen drei RS‑Elementen. Srp2 enthält zwei N‑terminale RBDs und zwei C‑terminale Elemente mit SR‑ und SP‑Dipeptid‑Motiven, die wir als SR1 und SR2 bezeichnen. Auch hier detektierte die Phosphoprotein‑Analyse phosphorylierte Serine in diesen Elementen. An zwei Elementen (SR1 und SR2) wurde eine umfassende Mutationsanalyse durchgeführt, indem Serin durch andere Aminosäuren ersetzt und die Auswirkungen der Mutationen in vivo geprüft wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass das GFP‑Srp2‑Fusionsprotein bei Mutation sämtlicher Serine in beiden Elementen nicht in den Zellkern gelangen konnte, sondern in unterschiedlichen, in der Zelle verteilten Punkten nachweisbar war.

Referenz:

1. Luetzelberger M; et al. The Prp4 Kinase: Its Substrates, Function and Regulation in pre-mRNA Splicing. Protein Phosphorylation in Human Health. 2012.