Entdeckung der PRP4-Kinase

Vor fünfundzwanzig Jahren schlugen wir und andere vor, dass die Arten von Introns, die in der Spalthefe F. saccharomyces vorkommen, eine andere Art von Introns darstellen, die in Saccharomyces cerevisiae gefunden werden. Diese Empfehlung basiert hauptsächlich auf der Beobachtung, dass Transkripte des kleinen T-Antigens des simianen Virus 40 (SV40), die 66 nt Introns aufweisen, genau dargestellt werden und kleine T-Antigen-Proteine in Schizosaccharomyces pombe synthetisiert werden, jedoch keine Synthese erfolgt. Wir verwendeten Spalthefe und erzeugten temperaturempfindliche (ts) Mutanten, um diejenigen Mutanten zu screenen, die bei begrenzten Temperaturen auf Defekte bei der prä-mRNA-Spleißung hinweisen. Für diese Screens konstruierten wir ein künstliches Reportergen unter Verwendung des natürlichen intronfreien ura4-Gens, das die Carboxylase kodiert, die an der Uracilsynthese beteiligt ist. Die Einfügung eines Introns in das ura4-Gen führte zur Entdeckung, dass Introns in Schizosaccharomyces pombe unabhängig von ihrem Exon-Hintergrund identifiziert werden können. Es wurde dann gezeigt, dass Introns in Schizosaccharomyces pombe durch einen Mechanismus identifiziert wurden, der jetzt als "Intron-Definition" bezeichnet wird. Der ts-Mutant wurde mit einem Plasmid transformiert, das eine 108 bp Intronsequenz im ura4-Gen enthält. Dann wurde die Anwesenheit von mRNA und prä-mRNA des ura4-108I-Transkripts unter den Bedingungen des Wachstums (erlaubte Temperatur von 25 °C) und des Nicht-Wachstums (eingeschränkte Temperatur von 36 °C) verglichen. Von den Hunderten von ts-Mutanten zeigten drei gespleißte (mRNA) und ungespleißte (prä-mRNA) Transkripte des ura4-I108-Reportergens bei zulässigen Temperaturen, aber die mRNA war zeitabhängig, als sie auf eine begrenzte Temperatur übertragen wurde. Ein sexueller Rückgang wurde beobachtet, während die prä-mRNA stabil blieb. Dies deutet darauf hin, dass das ura4-108I-Gen weiterhin transkribiert wurde, aber künstliche Introns unter diesen Bedingungen nicht entfernt wurden. Darüber hinaus wurden die natürlichen Introns der cdc2-Transkripte in diesen Mutanten bei der begrenzten Temperatur nicht entfernt.

Mammalian Prp4K ist an anderen zellulären Prozessen beteiligt

Es wurde gezeigt, dass das Säugetier-Prp4K mit vielen verschiedenen zellulären Strukturen und definierten Proteinen (z. B. Stellen, Spleißosom-Partikel, Chromatin-Gewebe-Komplexe) interagiert und Proteine am Kinetochor co-lokalisiert und an Kontrollpunkten der Gewebe-Spindel-Assembly beteiligt ist.

Prp4-Kinase und ihr Substrat

Zwei Proteinkinasen, die Spalthefe-Prp4-Kinase und die chimäre Maus-Prp4-Kinase, bestehen aus einem Maus-Kinasedomäne, die der N-terminalen Prp4 von Schizosaccharomyces pombe vorausgeht, und reichern sie in vitro für die Phosphorylierung des Arginin/Serin RS-Domäne an. Das Säugetierprotein ASF/SF2. Dieses Protein gehört zur SR-Superfamilie der Spleißfaktoren. Das SR-Protein besteht aus einem oder zwei N-terminalen RNA-Bindungsdomänen (RBDs) und einem C-terminalen arginin-/serinreichen (RS) Domäne. Mitglieder der SR-Proteinfamilie bei Säugetieren sind an der konstitutiven Spleißung beteiligt und sind spezifische Regulatoren der alternativen Spleißung. Sie binden an ihre Partner und kombinieren Spleißung mit Transkription und RNA-Ausgabe. Die allgemeine Funktion der SR-Proteine wird durch reversible Phosphorylierung reguliert. In der Spalthefe wurden zwei SR-Proteine identifiziert. Srp1 enthält ein RBD am N-Terminus, gefolgt von drei Serinelementen, die wir RS1, RS2 und RS3 nennen, die verschiedene Mengen von SR- und SP-Dipeptiden enthalten. Eine phosphorylierte proteomische Analyse der Spalthefe ergab mehrere phosphorylierte Serine in diesen drei RS-Elementen. Srp2 enthält zwei N-terminale RBD und zwei SR- und SP-Dipeptid-Anzeigeelemente am C-Terminus, die wir SR1 und SR2 nennen. Auch hier wurde in diesen Elementen phosphoryliertes Serin nachgewiesen. Umfassende Mutationsanalysen wurden an zwei Elementen (SR1 und SR2) durchgeführt, indem Serin durch andere Aminosäuren ersetzt und die Auswirkungen der Mutationen in vivo getestet wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass, als beide Serine in beiden Elementen mutiert wurden, das GFP-Srp2-Fusionsprotein nicht in den Zellkern eintreten konnte, sondern an verschiedenen Punkten in der Zelle verteilt gefunden wurde.

Referenz:

1. Luetzelberger M; et al. The Prp4 Kinase: Its Substrates, Function and Regulation in pre-mRNA Splicing. Protein Phosphorylation in Human Health. 2012.