Der spektrophotometrische Test ist ein klassischer Enzymtest und bleibt nach wie vor der am häufigsten verwendete Test aufgrund der geringen Kosten und der robusten Reproduzierbarkeit. Während eines spektrophotometrischen Tests verfolgt der Bediener den Verlauf einer Enzymreaktion, indem er die Änderungen in der Intensität des von der Reaktionslösung absorbierten oder gestreuten Lichts misst. Die meisten Tests verwenden die UV/Visible (UV/vis) Spektroskopie als Nachweismethode, die normalerweise im Wellenlängenbereich von 100-1100 nm liegt. Wenn das Licht im sichtbaren Bereich liegt, was bedeutet, dass die Wellenlänge 400-700 nm oder breiter 360-900 nm beträgt, kann die Farbe des Tests mit bloßem Auge sichtbar erfasst werden. Daher werden diese Arten von Tests auch als kolorimetrische Tests bezeichnet.

Wenn die UV/vis-Spektroskopie durchgeführt wird, um die Reaktionsgeschwindigkeit oder die Katalyseeffizienz zu bestimmen, zeigt die Reaktionslösung Farb- oder Helligkeitsänderungen von Reaktanten zu Produkten, und solche Änderungen können mit dem UV/vis-Spektrometer erkannt werden. Anschließend kann die Geschwindigkeitskonstante dieser Enzymreaktion quantifiziert werden, indem das UV/vis-Absorptionsspektrum über einen Zeitraum gemessen wird. Oft wird als erster Schritt die optimale Wellenlänge zur Detektion aller an der Reaktion beteiligten Spezies bestimmt. Die ideale Wellenlänge sollte den Unterschied zwischen Reaktant und Produkt deutlich anzeigen, während Störungen durch andere Chemikalien minimal bleiben. Manchmal müssen mehr als eine Wellenlänge verwendet werden, um starke Signale zur Berechnung der Enzymaktivität zu erzeugen. Zum Beispiel werden die häufigen Cofaktoren NADH und NADPH häufig in Enzymaktivitätstests verwendet, da sie in den reduzierten Formen UV-Licht absorbieren und nicht in den oxidierten Formen. Ein Oxidoreduktase, die NADH oder NADPH als Cofaktor verwendet, kann daher charakterisiert werden, indem die Abnahmen der UV-Absorption bei einer Wellenlänge von 340 nm verfolgt werden, was ein Zeichen dafür ist, dass der Cofaktor verbraucht wird, während die Enzymreaktion fortschreitet.

Bei der Messung der Enzymreaktion sind die Empfindlichkeit des Detektors und die Stabilität des gesamten Spektroskopiesystems entscheidend für eine zuverlässige Messung. Das erste Attribut gewährleistet die Erkennung subtiler Änderungen in der Lichtintensität einer Enzymreaktion. Letzteres sorgt für niedrige Schwankungen und Geräuschpegel. Gemeinsam steuern die beiden Aspekte des Instruments das Signal-Rausch-Verhältnis, und hochwertige Instrumente können Enzymaktivitäten in viel mehr Fällen testen als ein durchschnittliches Instrument.

Der kolorimetrische Test verwendet die gleichen Prinzipien zur Erkennung und Messung von Enzymaktivitäten, unterscheidet sich jedoch nur in der Lichtwellenlänge von der UV-Spektroskopie. Der MTT-Test ist ein typisches Beispiel für kolorimetrische Tests. Der MTT-Test verwendet einen Tetrazoliumfarbstoff als Substrat, um die zelluläre Stoffwechselaktivität zu bewerten. Im Allgemeinen kann die Anzahl der lebensfähigen Zellen oder das Vitalniveau der Zellen durch das Aktivitätsniveau der NAD(P)H-abhängigen zellulären Oxidoreduktase-Enzyme widergespiegelt werden. In vitalen Zellen reduzieren die Enzyme den Tetrazoliumfarbstoff MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid] zur Formazan-Form, die eine lila Farbe hat und leicht zur Quantifizierung der Enzymaktivität verwendet werden kann. Andere Farbstoffe können auch für ähnliche Zwecke verwendet werden, darunter XTT, MTS und die WSTs, oft in Verbindung mit dem Elektronenakzeptor PMS [1-Methoxyphenazinmethosulfat]. Allerdings haben das Lösungsmittel, die Reaktionsbedingungen und die zellulären Aktivitätsmechanismen erhebliche Auswirkungen auf die Ergebnisse des MTT- oder anderer Tests. Daher sollte immer ein Kontrolltest durchgeführt werden, und die Ergebnisse sollten durch eine andere Methode bestätigt werden. 

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