Der spektrophotometrische Assay ist ein klassischer Enzymtest und nach wie vor der am weitesten verbreitete Assay, da er kostengünstig ist und eine robuste Reproduzierbarkeit aufweist. Bei einem spektrophotometrischen Assay verfolgt die durchführende Person den Verlauf einer Enzymreaktion, indem sie Änderungen der Intensität des von der Reaktionslösung absorbierten oder gestreuten Lichts misst. Die meisten Tests verwenden die UV/Vis‑Spektroskopie (UV/Vis) als Detektionsmethode, die üblicherweise in den Wellenlängenbereich von 100–1100 nm fällt. Liegt das Licht im sichtbaren Bereich, d. h. bei einer Wellenlänge von 400–700 nm oder weiter gefasst 360–900 nm, kann die Farbe des Assays mit bloßem Auge wahrgenommen werden. Daher werden diese Tests auch als kolorimetrische Assays bezeichnet.

Wenn die UV/Vis‑Spektroskopie zur Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit oder der katalytischen Effizienz eingesetzt wird, zeigt die Reaktionslösung Farb- oder Helligkeitsverschiebungen von den Edukten zu den Produkten, die vom UV/Vis‑Spektrometer detektiert werden können. Anschließend kann die Geschwindigkeitskonstante dieser Enzymreaktion quantifiziert werden, indem das UV/Vis‑Absorptionsspektrum über einen definierten Zeitraum gemessen wird. Häufig wird als erster Schritt die optimale Wellenlänge zur Detektion aller an der Reaktion beteiligten Spezies bestimmt. Die ideale Wellenlänge sollte den Unterschied zwischen Edukt und Produkt eindeutig abbilden, während Interferenzen durch andere Chemikalien minimal bleiben. Mitunter müssen mehrere Wellenlängen verwendet werden, um ausreichend starke Signale zur Berechnung der Enzymaktivität zu erhalten. Beispielsweise werden die gängigen Cofaktoren NADH und NADPH häufig in Enzymaktivitätsassays eingesetzt, da sie in reduzierter Form UV‑Licht absorbieren, nicht jedoch in oxidierter Form. Eine Oxidoreduktase, die NADH oder NADPH als Cofaktor nutzt, kann daher charakterisiert werden, indem die Abnahme der UV‑Absorption bei 340 nm verfolgt wird, was darauf hinweist, dass der Cofaktor im Verlauf der Enzymreaktion verbraucht wird.

Bei der Messung der Enzymreaktion sind die Empfindlichkeit des Detektors und die Stabilität des gesamten spektroskopischen Systems entscheidend für eine zuverlässige Messung. Erstere gewährleistet die Detektion subtiler Änderungen der Lichtintensität während einer Enzymreaktion. Letztere sorgt für geringe Schwankungen und niedrige Rauschpegel. Zusammen bestimmen beide Aspekte das Signal‑zu‑Rausch‑Verhältnis; hochwertige Instrumente ermöglichen die Prüfung von Enzymaktivitäten in deutlich mehr Anwendungsfällen als ein durchschnittliches Gerät.

Der kolorimetrische Assay basiert auf denselben Prinzipien zur Detektion und Messung von Enzymaktivitäten, unterscheidet sich jedoch hinsichtlich der verwendeten Lichtwellenlängen von der UV‑Spektroskopie. Der MTT‑Assay ist ein typisches Beispiel für kolorimetrische Assays. Der MTT‑Assay verwendet einen Tetrazoliumfarbstoff als Substrat zur Beurteilung der zellulären metabolischen Aktivität. Im Allgemeinen können die Anzahl lebensfähiger Zellen bzw. der Vitalitätsgrad von Zellen durch das Aktivitätsniveau NAD(P)H‑abhängiger zellulärer Oxidoreduktase‑Enzyme widergespiegelt werden. In vitalen Zellen reduzieren diese Enzyme den Tetrazoliumfarbstoff MTT [3‑(4,5‑Dimethylthiazol‑2‑yl)‑2,5‑Diphenyltetrazoliumbromid] zur Formazan‑Form, die eine violette Farbe aufweist und sich zur Quantifizierung der Enzymaktivität gut eignet. Für ähnliche Zwecke können auch andere Farbstoffe eingesetzt werden, darunter XTT, MTS und die WSTs, häufig in Kombination mit dem Elektronenakzeptor PMS [1‑Methoxyphenazin‑Methosulfat]. Allerdings haben Lösungsmittel, Reaktionsbedingungen und Mechanismen der Zellaktivität einen erheblichen Einfluss auf die Ergebnisse des MTT‑ oder anderer Assays. Daher sollte stets parallel ein Kontrolltest durchgeführt werden, und die Ergebnisse sollten durch eine weitere Methode bestätigt werden. 

Zugehörige Dienstleistungen

Enzymologie‑Assays
Messung der Enzymaktivität
Enzymkatalytische Mechanismen