Der spektrophotometrische Test ist ein klassischer Enzymtest und bleibt aufgrund der niedrigen Kosten und der robusten Reproduzierbarkeit nach wie vor der am weitesten verbreitete Test. Während eines spektrophotometrischen Tests verfolgt der Anwender den Verlauf einer Enzymreaktion, indem er die Veränderungen in der Intensität des vom Reaktionsgemisch absorbierten oder gestreuten Lichts misst. Die meisten Tests verwenden die UV/vis (UV/visibel) Spektroskopie als Nachweismethode, die üblicherweise im Wellenlängenbereich von 100-1100 nm liegt. Befindet sich das Licht im sichtbaren Bereich, also im Wellenlängenbereich von 400-700 nm oder weiter gefasst 360-900 nm, kann die Farbe des Tests mit bloßem Auge sichtbar erfasst werden. Daher werden diese Tests auch als kolorimetrische Tests bezeichnet.

Wird die UV/vis-Spektroskopie zur Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit oder Katalyseeffizienz eingesetzt, zeigt das Reaktionsgemisch Farb- oder Helligkeitsänderungen von Edukten zu Produkten, und solche Veränderungen können mit dem UV/vis-Spektrometer detektiert werden. Anschließend kann die Geschwindigkeitskonstante dieser Enzymreaktion quantifiziert werden, indem das UV/vis-Absorptionsspektrum über einen bestimmten Zeitraum gemessen wird. Oft wird als erster Schritt die optimale Wellenlänge zur Detektion aller an der Reaktion beteiligten Spezies bestimmt. Die ideale Wellenlänge sollte den Unterschied zwischen Edukt und Produkt deutlich anzeigen, während Störungen durch andere Chemikalien minimal bleiben. Manchmal müssen mehr als eine Wellenlänge verwendet werden, um starke Signale zur Berechnung der Enzymaktivität zu erzeugen. Beispielsweise werden die häufig verwendeten Kofaktoren NADH und NADPH oft in Enzymaktivitätstests eingesetzt, da sie im reduzierten Zustand UV-Licht absorbieren, im oxidierten Zustand jedoch nicht. Eine Oxidoreduktase, die NADH oder NADPH als Kofaktor verwendet, kann daher charakterisiert werden, indem die Abnahme der UV-Absorption bei einer Wellenlänge von 340 nm verfolgt wird, was ein Zeichen dafür ist, dass der Kofaktor im Verlauf der Enzymreaktion verbraucht wird.

Bei der Messung der Enzymreaktion sind die Empfindlichkeit des Detektors und die Stabilität des gesamten Spektroskopiesystems entscheidend für eine zuverlässige Messung. Die erste Eigenschaft gewährleistet die Erkennung subtiler Veränderungen der Lichtintensität einer Enzymreaktion. Die zweite sorgt für geringe Schwankungen und Rauschpegel. Gemeinsam bestimmen diese beiden Aspekte des Instruments das Signal-Rausch-Verhältnis, und hochwertige Geräte können Enzymaktivitäten in weit mehr Fällen testen als ein durchschnittliches Instrument.

Der kolorimetrische Test verwendet die gleichen Prinzipien zur Detektion und Messung von Enzymaktivitäten, unterscheidet sich jedoch nur in der Lichtwellenlänge von der UV-Spektroskopie. Der MTT-Test ist ein typisches Beispiel für kolorimetrische Tests. Der MTT-Test verwendet einen Tetrazoliumfarbstoff als Substrat zur Beurteilung der zellulären Stoffwechselaktivität. Im Allgemeinen kann die Anzahl lebensfähiger Zellen oder das Vitalitätsniveau der Zellen durch das Aktivitätsniveau NAD(P)H-abhängiger zellulärer Oxidoreduktase-Enzyme widergespiegelt werden. In vitalen Zellen reduzieren die Enzyme den Tetrazoliumfarbstoff MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid] zur Formazan-Form, die eine violette Farbe aufweist und leicht zur Quantifizierung der Enzymaktivität verwendet werden kann. Andere Farbstoffe können für ähnliche Zwecke verwendet werden, darunter XTT, MTS und die WSTs, oft in Kombination mit dem Elektronenakzeptor PMS [1-Methoxyphenazin-Methosulfat]. Allerdings haben das Lösungsmittel, die Reaktionsbedingungen und die Mechanismen der Zellaktivität einen erheblichen Einfluss auf die Ergebnisse des MTT- oder anderer Tests. Daher sollte immer ein Kontrolltest parallel durchgeführt werden, und die Ergebnisse sollten durch eine andere Methode bestätigt werden. 

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