Alkoholoxidase

Alkohloxidase (AOX, EC 1.1.3.13) ist ein Flavoenzym, ein Oxidoreduktase, das die Oxidation von Alkohol zu dem entsprechenden Carbonylverbindung katalysiert und gleichzeitig Wasserstoffperoxid freisetzt. Der systematische Name dieses Enzyms ist Alkohol: Sauerstoff-Oxidoreduktase. Weitere gebräuchliche Namen sind Ethanoloxidase, Methanoloxidase. Nach der Substratspezifität können Alkohloxidasen grob in vier verschiedene Gruppen unterteilt werden, nämlich kurzkettige Alkohloxidase (SCAO), langkettige Alkohloxidase (LCAO), aromatische Alkohloxidase (AAO) und sekundäre Alkohloxidase (SAO). Alkohloxidasen stammen hauptsächlich aus Bakterien, Hefen, Pilzen, Pflanzen, Insekten und Weichtieren. SCAO und LCAO sind hauptsächlich intrazellulär, AAO und SAO werden meist in das Medium sekretiert.

Klassifikation

AOX benötigt einen flavinbasierten Cofaktor, um die Umwandlung von Alkoholen in die entsprechenden Aldehyde oder Ketone zu katalysieren. Das FAD in AOX ist eng mit dem Redoxzentrum des Enzyms verbunden und beteiligt sich am Transfer von Hydridionen vom Alkoholsubstrat zu molekularem Sauerstoff, wodurch H₂O₂ produziert wird. Die Aktivität von AOX wurde ursprünglich in Polystictus versicolor berichtet, und später isolierten die Forscher ein Enzym aus dem Basidiomyceten, das die Oxidation von Methanol und anderen niederen Alkoholen zu den entsprechenden Aldehyden und H₂O₂ katalysiert. Sie nannten das Enzym dann "Alkohloxidase", reinigten es bis zu einem kristallinen Zustand und fanden heraus, dass FAD eine prosthetische Gruppe des Enzyms ist. Nach der Substratspezifität kann die Alkohloxidase grob in vier verschiedene Gruppen unterteilt werden, nämlich kurzkettige Alkohloxidase (SCAO), langkettige Alkohloxidase (LCAO), aromatische Alkohloxidase (AAO) und sekundäre Alkohloxidase (SAO).

Struktur

Wie andere Mitglieder der Glukose-Methanol-Cholin (GMC) Oxidoreduktase-Superfamilie enthält Pichia pastoris AOX1 zwei charakteristische Domänen, einschließlich der FAD-Bindungsdomäne (Reste 1-155, 192-306 und 568-663) und der Substratbindungsdomäne (Reste 156-191 und 307-567). Die am stärksten konservierte Region ist die FAD-Bindungsdomäne, die vier Sequenzfragmente enthält, die über die primäre Sequenz verteilt sind, mit den charakteristischen FAD-Nukleotid-Bindungsstellen-Sequenzen GXGXXG und GGGSSG in P. pastoris AOX1.

Abbildung 1. Die Struktur einer P. pastoris AOX1-Untereinheit. (Koch C. 2016)

Die reife aktive Form von AOX1 ist ein Oligomer, das aus acht identischen Untereinheiten besteht, von denen jede ein nicht-kovalent gebundenes Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD) als prosthetische Gruppe trägt. Der P. pastoris AOX1-Kristall ist ein Homo-Oktamer mit einer Größe von etwa 121,8 Å x 133,8 Å x 134,5 Å. Das Oktamer scheint ein Tetramer von Dimeren zu sein, kann aber auch als zwei gegenüberliegende Tetramere beschrieben werden. Die beiden Tetramere interagieren nur durch die Substratbindungsdomänen, während die FAD-Bindungsdomänen die äußere Oberfläche des Oligomers einnehmen. Im Tetramer bildet jedes Monomer 20 Wasserstoffbrücken und 8 Salzbrücken mit jeweils zwei benachbarten Untereinheiten und nimmt 7% (1985 Ų) der Kontaktoberfläche in Paarinteraktionen ein. Im Gegensatz dazu wird jedes Inter-Tetramer-Dimer durch breitere Inter-Untereinheitskontakte stabilisiert (40 Wasserstoffbrücken), die 10% (2700 Ų) der Kontaktoberfläche verbergen. Wenn ein Oktamer gebildet wird, bildet jedes Monomer etwa 115 Wasserstoffbrücken und 16 Salzbrücken mit benachbarten Untereinheiten und verbirgt etwa 29% (8300 Ų) seiner Kontaktoberfläche, was auch die Stärke des Oktamers anzeigt. Die Bildung des oligomeren Zustands von AOX1 wird hauptsächlich durch die Einfügung zahlreicher Wechselwirkungen zwischen den Monomeren (Reste 326-351, 486-548, 247-251, 638-663) erleichtert. Obwohl eine Einfügung in der Substratbindungsdomäne (367-386) lokalisiert ist, wird ein Helix-Schleife-Helix-Motiv gebildet, das von den anderen Monomeren entfernt ist und daher nicht an irgendeiner Inter-Untereinheitsinteraktion teilnimmt, sind die verbleibenden zwei Einfügungen (326-351, 486-548) an der Bildung von Tetrameren und Dimer-Unterassemblies des AOX1-Oktamers beteiligt. Ihre Länge und inhärente strukturelle Plastizität, kombiniert mit der gegenüberliegenden Orientierung der einzelnen, erleichtern die Schaffung eines breiten Spektrums von Interaktionsnetzwerken, an denen jedes Plug-in gleichzeitig an der Stabilisierung der beiden Unterassemblies beteiligt ist. Im Gegensatz dazu beteiligt sich die entfernte kurze Schleifenverlängerung (Reste 247-251) und die C-terminale Verlängerung der FAD-Bindungsdomäne nur an der Bildung von Tetrameren durch die Interaktion von zwei benachbarten Monomeren, die an der Bildung des Tetramers beteiligt sind.

Abbildung 2. Die quartäre Struktur von P. pastoris AOX1. (Koch C. 2016)

Katalytischer Mechanismus

Die Analyse der Kristallstruktur von AOX1 zeigte, dass die aktive Stelle für das Lösungsmittel unzugänglich war. Obwohl das katalytische Zentrum von AOX1 für das Lösungsmittel unzugänglich ist, können an allen aktiven Stellen Elektronendichte-Spitzen beobachtet werden, die Wasserstoffen entsprechen. Das Wassermolekül nimmt eine kleine Höhle mit einem Volumen von etwa 135 ų ein und ist über Wasserstoffbrücken an die Seitenkette von Asn616, His567 und das N5-Atom des Isoalloxazinrings gebunden. Weitere Studien haben ergeben, dass die Seitenketten von Phe98 und Met100 strukturelle Elemente sein könnten, die es dem Substrat ermöglichen, in die aktive Stelle einzutreten. Das katalytische Zentrum der acht Untereinheiten von AOX1 enthält jeweils ein nicht-kovalent gebundenes FAD-Molekül.

Abbildung 3. Die aktive Stelle von AOX1. (Koch C. 2016)

Methylotrophe Hefen haben einen Regulationsmechanismus entwickelt, um die Aktivität der Alkohloxidase fein abzustimmen, indem sie natürlich vorkommende Ribityl-FAD-Moiety automatisch in modifiziertes Arabityl-FAD (a-FAD) umwandeln. a-FAD reduziert leicht V_max und verringert signifikant den K_m-Wert des Enzyms für das Substrat Methanol, was physiologisch relevant in Kulturen mit niedrigen Methanolkonzentrationen ist. Da die von AOX katalysierte mehrstufige Reaktion direkt vom Redoxpotential des gebundenen Cofaktors abhängt, wird eine Erhöhung des FAD-Redoxpotentials zur Gesamtumwandlung des Enzyms beitragen. Eine Änderung der chiralen Konfiguration am atomaren C2' im FAD von AOX führt zur Bildung einer neuen intramolekularen Wasserstoffbrücke zwischen der modifizierten a-FAD-Aryl-C2'-OH-Gruppe und dem N1-Atom des Isoalloxazinringsystems, was höchstwahrscheinlich das Redoxpotential des FAD-Cofaktors moduliert. Die katalytische Oxidationsreaktion beginnt mit der Entfernung des Hydroxylprotons des Substrats durch die katalytische Base und der Bildung einer Alkoxidart, bevor der Hydridtransfer vom α-Kohlenstoff des Substrats erfolgt. Für andere Alkohloxidasen (AAO, GO, CDH, P2O, PNO) wird das konservative His von His/His, His/Asn oder His/Pro-Paaren als katalytische Base betrachtet und trägt daher während der Katalyse eine teilweise positive Ladung. His567 in AOX1 wurde als katalytische Base identifiziert, die Alkohol aktiviert. Die schrittweise Reaktion, die von AOX1 katalysiert wird, erfordert, dass das Enzym die negative Ladung des Alkoxids durch intermolekulare Wechselwirkungen stabilisiert, die möglicherweise durch zwei konservierte polare Reste, His567 und Asn 616, gebildet werden. Dieser Rest befindet sich in einer Wasserstoffbrücke, die vom Alkoxidstandort entfernt ist. Da der Transfer des Hydridions durch die N5-Position des Isoalloxazinrings erfolgt, kann die polare Gruppe, die dem N5-Atom benachbart ist, den Übergangszustand stabilisieren. In AOX1 ist der Rest, in dem die OH-Gruppe platziert ist, Phe98.

Abbildung 4. Modifiziertes a-FAD. (Koch C. 2016)

Literaturverzeichnis